下利用基因工程蓝藻转化CO2生产3-羟基 丙酸量的图；
[0040] 图4是本发明实施例5中，使用液相色谱仪和液质联用仪验证基因工程蓝藻所生 产的3-羟基丙酸的色谱图和质谱图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验 方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可 从商业途径得到。
[0042] 本发明使用的菌株和生长条件如下：
[0043] 大肠杆菌DH5 α，用于基因克隆的宿主菌，购自Invitrogen公司，使用LB液体培养 基，37°C，200转/分钟摇床中培养，或使用LB固体培养基，37°C培养箱中培养。需要时，在 LB培养基中加入100 μ g/mL的壮观霉素。
[0044] 细长聚球藻（Synechococcus elongatus) PCC 7942 (ATCC 33912)购自美国模式培 养物集存库（American type culture collection)，使用BGll液体培养基，30°C，光照强度 100 μ E .s-1 ·πΓ2,并连续通入5%体积比0)2气体进行培养；或使用BGll固体培养基，30°C， 光照强度100 μ E · ?Γ1 ·πΓ2条件下培养。需要时，在BGll培养基中加入20 μ g/mL的壮观霉 素。
[0045] 其中，所述LB培养基配方是：IOg蛋白胨，5g酵母膏，IOg NaCl，pH 7. 0,蒸馏水定 容至1L，121°C灭菌20分钟；LB固体培养基中加入15g/L琼脂粉。
[0046] 上述BGll培养基配方是：10mL BGll母液，ImL柠檬酸铁铵溶液（6g/L)，ImL Na2CO3 溶液（20g/L)，ImL K2HPO4溶液（30. 5g/L)，蒸馏水定容至1L，121°C灭菌20分钟；BGll固体 培养基中加入15g/L琼脂粉。
[0047] 上述BGll 母液的配方是：149. 6g NaNO3, 7. 5g MgSO4 ·7Η20,3· 6g CaCl2 ·2Η20,0· 6g 柠檬酸，I. 12mL 0. 25M NaEDTA溶液（pH 8. 0)，IOOmL微量元素溶液，蒸馏水定容至1L。
[0048] 上述 BGll 微量元素溶液的配方是：2. 86g H3BO3,1. 81g MnCl2 · 7Η20,0· 22g ZnSO4 · 7Η20,0· 39g Na2MoO4 · 2Η20,0· 079g CuSO4 · 5Η20,0· 049g Co(NO3)2 · 6H20,蒸馏水定 容至1L。
[0049] 本发明所使用的质粒为口八厘2991(518118如8311(15.5.6〇1(1611，工 Bacteriol.，1991，173, 7525)及其衍生质粒，用于将三碳化合物合成途径相关基因通过同 源重组整合到细长聚球藻PCC 7942的基因组中进行表达。
[0050] 实施例1 :携带有二羟基丙酮合成途径相关基因的质粒PAM-YW2的构建
[0051] 1)提取 pAM2991 质粒
[0052] 将携带有pAM2991质粒的大肠杆菌DH5 a (PAM2991)按照1 %的接种量，接种至 5mL含有壮观霉素（100 μ g/mL)的LB液体培养基中，37°C，200转/分钟摇床中培养12h。 利用培养后的菌体利提取PAM2991质粒。
[0053] 2)扩增Ptrc启动子
[0054] 使用合成的引物，从pAM2991质粒中，PCR扩增得到Ptrc启动子。
[0055] Ptrc 上游引物 5' -AGATCTGACAGCTTATCATCGACT-3'，携带一个 BglII 酶切位点；
[0056] Ptrc 下游引物 5' -CTCGAGTTCCATGGTCTGTTTCCT-3'，携带一个 XhoI 酶切位点。
[0057] 上述Ptrc启动子的序列长度为268个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0058] 3)pAM-P2质粒的构建
[0059] 将PCR扩增得到的Ptrc片段回收；用BglII和XhoI酶切回收后的Ptrc片段和 pAM2991质粒，并回收；用T4DNA连接酶（购买自New England Biolabs公司）进行连接， 得到重组质粒PAM-P2。
[0060] 4)甘油-3-磷酸酶基因 gpp 1的扩增
[0061] 采用常规的方法制备酿酒酵母的基因组DNA，使用合成的引物从酿酒酵母基因组 DNA中PCR扩增得到甘油-3-磷酸酶基因 gpp 1。
[0062] gppl 上游引物 5' -GAATTCATGCCTTTGACCACAAAACC-3'，携带一个 EcoRI 酶切位点；
[0063] gppl 下游引物 5' -AGATCTTTACCATTTCAACAAGTCAT-3'，携带一个 BglII 酶切位点。
[0064] 上述gppl基因序列长度为753个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0065] 5)甘油脱氢酶基因 dhaD的扩增
[0066] 采用常规的方法制备肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955的基因组DNA，使用合成的引物 从肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955基因组DNA中PCR扩增得到甘油脱氢酶基因 dhaD。
[0067] dhaD 上游引物 5' -CTCGAGATGCTAAAAGTTATTCAAT-3'，携带一个 XhoI 酶切位点；
[0068] dhaD 下游引物 5' -GGATCCTTAACGCGCCAGCCACTGC-3'，携带一个 BamHI 酶切位点。
[0069] 上述dhaD基因序列长度为1098个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0070] 6)pAM-YW2质粒的构建
[0071] 用EcoRI和BglII酶切回收后的gpp 1片段和pAM-P2质粒，回收后，用T4DNA 连接酶进行连接，得到重组质粒pAM-P2-gpp 1。用Xho I和BamHI酶切dhaD基因片段和 pAM-P2-gppl质粒，回收后，用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pAM-YW2。重组质粒 PAM-YW2可与细长聚球藻PCC 7942基因组特定位点（NSI)进行同源重组，将二羟基丙酮合 成途径相关基因转入细长聚球藻PCC 7942基因组中，如图1所示。
[0072] 实施例2 :携带有3-羟基丙酸合成途径相关基因的质粒pAM-YW3的构建
[0073] 1)提取 pAM-P2-gppl 质粒，
[0074] 将携带有pAM-P2_gppl质粒的大肠杆菌DH5 a (PAM2991)按照1 %的接种量，接种 至5mL含有壮观霉素（100 μ g/mL)的LB液体培养基中，37°C，200转/分钟摇床中培养12h。 利用培养后的菌体利提取pAM-P2-gppl质粒。
[0075] 2)甘油脱水酶基因 dhaB的扩增
[0076] 采用常规的方法制备丁酸梭菌DSM 10702的基因组DNA，使用合成的引物从丁酸 梭菌DSM 10702基因组DNA中PCR扩增得到甘油脱水酶基因 dhaB。
[0077] dhaB 上游引物 5' -CTCGAGATGATAAGTAAAGGATTTAG-3'，携带一个 XhoI 酶切位点；
[0078] dhaB 下游引物 5'-GCGGCCGCTTACTCAGCTCCAATTGTGC-3'，携带一个NotI 酶切位点。
[0079] 上述dhaB基因序列长度为3306个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0080] 3)醛脱氢酶基因 puuC的扩增
[0081] 采用常规的方法制备大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA，使用合成的引物从大肠 杆菌BL21 (DE3)基因组DNA中PCR扩增得到醛脱氢酶基因 puuC。
[0082] puuC 上游引物 5 ' -GCGGCCGCACAGGAGTCATAATGAATTT-3 '，携带一个 Not I 酶切位 占.
[0083] puuC 下游引物 5' -GGATCCTCAGGCCTCCAGGCTTAT-3'，携带一个 BamHI 酶切位点。
[0084] 上述puuC基因序列长度为1488个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0085] 4) pAM-YW3质粒的构建
[0086] 用XhoI和NotI酶切回收后的dhaB片段，用NotI和BamHI酶切回收后的puuC片 段，用XhoI和BamHI酶切pAM-P2-gppl质粒，回收后，T4DNA连接酶连接dhaB片段、puuC 片段和pAM-P2-gppl质粒，得到重组质粒pAM-YW3。重组质粒pAM-YW3可与细长聚球藻PCC 7942基因组特定位点（NSI)进行同源重组，将3-羟基丙酸合成途径相关基因转入细长聚球 藻PCC 7942基因组中，如图1所示。
[0087] 实施例3 :蓝藻的转化和基因工程