噬菌体展示文库及其应用和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种噬菌体展示 文库、该文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途以及制备该文库的方法；本发明还 涉及编码该噬菌体展示文库所展示的多肽的DNA组合物、用于构建所述噬菌体展示文库的 噬菌体质粒组合物、含有该噬菌体质粒组合物的宿主细胞库、用于构建所述噬菌体展示文 库的引物及其用途以及包括所述噬菌体展示文库的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基 因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装 而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体属于单链DNA病毒，包括FI、fd和M13三类。噬 菌体DNA能够在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，同时可分泌出大量成熟 的噬菌体颗粒。噬菌体的单链DNA长约7000bp，不同类型的噬菌体的一级结构极为相似，基 因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构 蛋白P III和p VIL噬菌体单链DNA被包裹在由大约2700-3000个主要衣壳蛋白p VDI组成的 管状结构中。另外，次要衣壳蛋白P III通过与大肠杆菌的F菌毛结合而引起感染，其是噬菌 体感染宿主所必需的。
[0003] 噬菌体展示平台已经发展成熟，其通过将目标蛋白融合在pill蛋白基因中的适 当位置，从而在噬菌体表面展示目标蛋白（参见文献"Bass, S.，Proteins, 8:309 (1990) ; L owman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)，'）。 由于融合有目标基因的pin蛋白基因处于低表达状态且野生型pin蛋白仍在表达，因 此能够很好地维持噬菌体的感染性。与此相关的专利文献如：美国专利No. 5, 723, 286、 美国专利No. 5, 432, 018、美国专利No. 5, 580, 717、美国专利No. 5, 427, 908和美国专利 No. 5, 498, 530。
[0004] 利用噬菌体文库筛选针对靶蛋白、多肽或小分子的多肽或蛋白的技术已被广泛研 究（参见文献 "Tonikian，R·，Nature protocols, 2:1368 (2007)"）。其基本思路为：将设计 好的噬菌体文库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体， 然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，用洗脱的噬菌体感染宿主细胞， 之后繁殖扩增，进行下一轮孵育洗脱，经过3轮~5轮的"吸附-洗脱-扩增"后，与靶分子 特异结合的噬菌体得到高度富集。通过噬菌体ELI SA，可从富集噬菌体输出文库中挑选出来 具有期望结合特性的单克隆噬菌体。
[0005] 噬菌体展示技术可以产生包含101°种以上不同展示蛋白的文库，这与人体所 能产生的抗体总数相近，从而使基于此技术的抗体筛选成为可能。然而，由于抗体的互 补决定区全部可随机产生1〇 7°种以上的变化，因此，科学地设计抗体的噬菌体展示文库 将是决定筛选成功率和效率的关键因素。在这方面，已经有很多研究成果(例如，参见文 献"TomLinson，Nature Biotech. (2000)，18:989-994，，、"Barbas，PNAS9113809 (1994)，，、 " Yelton，D E，J. Immunology, 15511994(1995)，'、" Jackson，J. R.，J. Immunology, 15413310(1995)" 和 "Hawkins, R E, J. Mol. Biology, 2261889(1992)"）。
[0006] 但以上研究针对的是常规抗体的筛选，所得抗体针对的表面决定簇随机，并且对 抗原的功能性、致病性点突变不敏感、无法识别；并且在构建噬菌体文库时，通常需要首先 经过免疫动物的步骤，费时费力。
[0007] 美国专利文献No. 7985840B2和No. 2013/0244883A1公开了一种噬菌体文库，以及 制备该噬菌体文库的方法。该方法对抗体CDR结构域中的溶剂可及且多样性的位点采用了 简并密码子突变，从而不需进行常规的免疫动物等步骤即可达到足够的多样性。然而，这 些方法都没有区分抗体中用于识别靶抗原的核心结合区和次要识别区，而是对轻链CDR1、 CDR2结构域和重链CDRl、CDR2结构域都采用了突变性较弱的弱随机突变简并密码子，只对 抗体轻链和重链CDR3结构域采用了突变性较强的强随机突变简并密码子，并且该强随机 突变简并密码子包括终止密码子。因此，该方法所制备的噬菌体文库的多样性对针对突变 抗原的抗体筛选没有优势，并且由于其使用了包括终止密码子的强随机突变，该文库所展 示的抗体中的稳定性抗体的比例较低，这导致该噬菌体文库的筛选效率较低。
【发明内容】
[0008] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种噬菌体展示文库、该文 库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途以及制备该文库的方法；本发明还涉及编码该 噬菌体展示文库所展示的多肽的DNA组合物、用于构建所述噬菌体展示文库的噬菌体质粒 组合物、含有该噬菌体质粒组合物的宿主细胞库、用于构建所述噬菌体展示文库的引物及 其用途以及包括所述噬菌体展示文库的试剂盒。
[0009] 具体而言，本发明提供了：
[0010] (1) 一种噬菌体展示文库，包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所 述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDRl结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性 重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDRl结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗 体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDRUCDR2和CDR3结构域以及 所述抗体性轻链CDRl、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位 点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突 变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包 括终止密码子。
[0011] (2)根据（1)所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用 Chothia编号系统编号时，所述强随机突变性位点为：所述抗体性重链CDRl结构域的第33 位氨基酸，所述抗体性重链⑶R2结构域的第50、52、56、58位氨基酸，所述抗体性重链⑶R3 结构域的第95至（95+k)位氨基酸，所述抗体性轻链CDRl结构域的第30、31位氨基酸，所 述抗体性轻链CDR2结构域的第50位氨基酸，以及所述抗体性轻链CDR3结构域的第91至 (91+j)位氨基酸；其中k为3至14的整数，j为3至6的整数。
[0012] (3)根据（1)或（2)所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性重链⑶R1、⑶R2和 CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有弱随机突变性位点，所 述弱随机突变性位点是溶剂可及且非保守性的位点，其是由弱随机突变简并密码子编码的 氨基酸，并且所述弱随机突变简并密码子不编码破坏所述多肽三维结构稳定性的氨基酸。
[0013] (4)根据（3)所述的噬菌体展示文库，其中所述弱随机突变性位点各自所包括的氨 基酸包括：在天然鼠源抗体相应位点处的出现频率至少为65%的氨基酸和/或出现频率之 和至少为65%的氨基酸。
[0014] (5)根据（3)所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用 Chothia编号系统编号时，
[0015] 所述抗体性重链⑶Rl结构域包含连续氨基酸序列 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9,其中Xl至X9依次对应所述Chothia编号系统的第27至第 35位，X7为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，X