AGA)，商业公司全基因合成邸0V核酸疫苗祀基 因序列：扎伊尔型邸0VG蛋白的祀基因序列如序列表中序列1所不；苏丹型邸0VG蛋白的 祀基因序列如序列表中序列2所示；科特迪瓦型邸0VG蛋白的祀基因序列如序列表中序列 3所示。
[0085] 2、邸0V核酸疫苗的获得
[0086] (1)重组载体的构建
[0087] 分别用限制性内切酶EcoRI和甜aI(TAKARA公司）双酶切邸0V核酸疫苗载体 pVAXUlnvitrogen公司，货号；V260-20)和上述S种邸0V核酸疫苗祀基因G蛋白的编码基 因序列（如序列表中序列1所示的扎伊尔型邸0VG蛋白的编码基因序列；如序列表中序列 2所示的苏丹型邸0VG蛋白的编码基因序列；如序列表中序列3所示的科特迪瓦型邸0VG 蛋白的编码基因序列），回收得到骨架载体和S个目的片段，利用连接酶分别连接骨架载体 和目的片段，得到重组载体pVZG、pVSG、pVCG。
[0088] 对S个重组载体pVZG、pVSG、pVCG分别进行测序验证。结果表明；重组载体pVZG为 将pVAXl载体的EcoRI和甜aI酶切位点间的DNA替换为如序列表中序列1中第1-2031 位所示的扎伊尔型邸0VG蛋白的编码基因序列，保持pVAXl载体的其他序列不变得到的 重组载体，表达的扎伊尔型邸0VG蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；重组载体 pVSG为将pVAXl载体的EcoRI和甜aI酶切位点间的DNA替换为如序列表中序列2中 第1-2031位所示的苏丹型邸0VG蛋白的编码基因序列，保持pVAXl载体的其他序列不变 得到的重组载体，表达扎伊尔型邸0VG蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示；重组载 体pVCG为将pVAXl载体的EcoRI和甜aI酶切位点间的DNA替换为如序列表中序列3 中第1-2031位所示的科特迪瓦型邸0VG蛋白的编码基因序列，保持pVAXl载体的其他序 列不变得到的重组载体，表达科特迪瓦型邸0VG蛋白的氨基酸序列如序列表中序列12所 /J、- 〇
[008引 似重组菌的获得
[0090] 将步骤（1)得到的S种重组载体pVZG、pVSG、pVCG分别转化感受态细菌D册a，涂 板，挑选单克隆。
[0091] 用质粒小提试剂盒小提重组菌D册a/pVZG、D册a/pVSG、D册a/pVCG质粒，并对 提取的质粒进行双酶切鉴定（见图2)，酶切得到大小约为3000bp和2000bp两条条带的细 菌为阳性菌，即为D册a/pVZG、D册a/pVSG、D册a/pVCG。
[0092] (3化BOV核酸疫苗的获得
[0093] 分别将D册a/pVZG、D册a/pVSG、D册a/pVCG重新大规模发酵培养至0D600约为 14,用质粒大提试剂盒大提质粒，得到pVZG(即为扎伊尔型邸0V核酸疫苗I)、pVSG(即为 苏丹型邸0V核酸疫苗II)和pVCG(即为科特迪瓦型邸0V核酸疫苗III)。
[0094] (4)浓度和纯度检测
[0095]对步骤（3)得到的S种核酸疫苗扎伊尔型邸0V核酸疫苗I、苏丹型邸0V核酸疫 苗II和科特迪瓦型邸0V核酸疫苗III的浓度和纯度（见图2)进行检测。结果表明；S种核 酸疫苗的浓度均在17111径/1111;八260/八280均为2.05，八260/八230均为2.24，纯度均超过95%， 均符合生物制品规程对核酸疫苗的要求，-70°CW下保存备用。
[0096] 二、邸0V假病毒的制备
[0097] 邸0V假病毒是借助慢病毒包装体系W邸0V的囊膜蛋白G蛋白取代HIV的ENV囊 膜蛋白，形成WEB0V的囊膜蛋白G蛋白为囊膜的假病毒，其能单轮感染敏感祀细胞，但不能 二次感染祀细胞，感染后其携带的EGFP基因将进入祀细胞并表达绿色巧光蛋白巧GFP)，在 巧光显微镜下，可测定其巧光灶数，巧光灶数的多少代表了假病毒的效价。具体如下：
[0098] 购买北京英茂盛业生物科技有限公司的=质粒慢病毒包装体系，293V慢病毒包装 细胞和293T慢病毒效价测定细胞。按照慢病毒操作说明书制备假病毒，并进一步优化，步 骤如下：
[0099] (1)转染前准备细胞
[0100] 在一个75平方厘米的细胞培养瓶中，调整293V细胞至合适浓度，加入20ml包含 10%热灭活的胎牛血清，1%双抗的DMEM培养基，放于37°C，5%C〇2培养箱培养；
[0101] (2)培养细胞血清的充分去除
[0102] 细胞达到70~80%铺满时，换16ml包含1 %双抗的DMBl培养基，放于37°C，5% C〇2培养箱培养2小时；
[0103] 0)转染前准备
[0104] 转染前准备一个15ml的细胞管，依次加入4ml0pti-MEM、80y1transfection reagent(Lipofectamine?2000)、40ygpLV、40ygpHelperl. 0 和 40yg上述一制备的核 酸疫苗，混匀30秒，室温静止20分钟，得到混合物；
[0105] 上述一制备的核酸疫苗分别为扎伊尔型邸0V核酸疫苗I、苏丹型邸0V核酸疫苗 II和科特迪瓦型邸0V核酸疫苗III。
[0106] (4)转染
[0107] 将混合物加入293V细胞，放于37°C，5 %C〇2培养箱；
[0108] (5)转染后12小时，用20ml包含1 %双抗的DMEM培养基取代W上转染培养基，放 于37°C，5%C〇2培养箱继续培养60小时；
[0109] (6)收集上清，并经0.2ym滤膜过滤，分装，放于-76 °C，待用；即为扎伊尔 型邸0V假病毒X狂aire)、苏丹型邸0V假病毒过（Sudan)、科特迪瓦型邸0V假病毒 Xn(Coted'Ivoire)。
[0110] (7)使用293T细胞，按照Reed-Muench法测定假病毒滴度，结果见图1和表1，6个 月内检测，S种假病毒滴度均超过1X10中FU/ml。
[0111] 表1、埃博拉病毒假病毒滴度结果
[0112]
【主权项】
1. 用于制备抗埃博拉病毒的免疫球蛋白F(aM ) 2的成套免疫原，由埃博拉病毒的核 酸疫苗、埃博拉病毒的亚单位疫苗和埃博拉病毒的病毒样颗粒疫苗组成； 所述埃博拉病毒的核酸疫苗为如下至少一种：扎伊尔型EBOV核酸疫苗I、苏丹型EBOV 核酸疫苗II和科特迪瓦型EBOV核酸疫苗III ; 所述埃博拉病毒的亚单位疫苗为如下至少一种：扎伊尔型EBOV亚单位疫苗IV、苏丹型 EBOV亚单位疫苗V和科特迪瓦型EBOV亚单位疫苗VI ; 所述埃博拉病毒的病毒样颗粒疫苗为如下至少一种：扎伊尔型EBOV VLP疫苗W、苏丹 型EBOV VLP疫苗VID和科特迪瓦型EBOV VLP疫苗IX ; 所述扎伊尔型EBOV核酸疫苗I为表达扎伊尔型EBOV G蛋白1编码基因的重组载体； 所述苏丹型EBOV核酸疫苗II为表达苏丹型EBOV G蛋白1编码基因的重组载体； 所述科特迪瓦型EBOV核酸疫苗III为表达科特迪瓦型EBOV G蛋白1编码基因的重组载 体； 所述扎伊尔型EBOV亚单位疫苗IV为扎伊尔型EBOV G蛋白2 ; 所述苏丹型EBOV亚单位疫苗V为苏丹型EBOV G蛋白2 ; 所述科特迪瓦型EBOV亚单位疫苗VI为科特迪瓦型EBOV G蛋白2 ; 所述扎伊尔型EBOV VLP疫苗W为表达扎伊尔型EBOV G蛋白1编码基因和扎伊尔型 EBOV VP40蛋白3编码基因的病毒样颗粒； 所述苏丹型EBOV VLP疫苗VID为表达苏丹型EBOV G蛋白1编码基因和苏丹型EB0VVP40 蛋白3编码基因的病毒样颗粒； 所述科特迪瓦型EBOV VLP疫苗IX为表达科特迪瓦型EBOV G蛋白1编码基因和科特迪 瓦型EBOV VP40蛋白3的病毒样颗粒； 所述扎伊尔型EBOV G蛋白1的氨基酸序列如序列表中序列10所示； 所述苏丹型EBOV G蛋白1的氨基酸序列如序列表中序列11所示； 所述科特迪瓦型EBOV G蛋白1的氨基酸序列如序列表中序列12所示； 所述扎伊尔型EBOV G蛋白2的氨基酸序列如序列表中序列13所示； 所述苏丹型EBOV G蛋白2的氨基酸序列如序列中序列14所示； 所述科特迪瓦型EBOV G蛋白2的氨基酸序列如序列15所示； 所述扎伊尔型EBOV VP40蛋白3的氨基酸序列如序列表中序列16所示； 所述苏丹型EBOV VP40蛋白3的氨基酸序列如序列表中序列17所示； 所述科特迪瓦型EBOV VP40蛋白3的氨基酸序列如序列表中序列18所示。
2. 根据权利要求1所述的成套免疫原，其特征在于： 所述埃博拉病毒核酸疫苗由所述扎