F_YA15的表达量随着脱水时间的延长而逐渐变高，至脱水处理 5h表达量达到对照的17. 9±0. 41倍，至脱水处理24h表达量又开始下调，见图2A。
[0090] 在高盐处理下，GmNF-YA15的表达量随着高盐时间的延长持续变高，至处理24h表 达量达到对照的10. 6 ±0. 29倍见图2B。
[0091] 在高温处理下，GmNF-YA15的表达量随着处理时间的延长而逐渐变高，至处理12h 表达量达到对照的7. 1±0. 31倍，之后表达量又开始下调，见图2C。
[0092] 在激素 ABA处理下，GmNF-YA15的表达量无显著的变化趋势，见图2D。
[0093] 在低温处理下，GmNF_YA15的表达量持续缓慢下调，见图2E。
[0094] 在双氧水处理下，GmNF-YA15的表达量在5h表达到对照的5. 07±0. 16倍，之后表 达量又缓慢下调，见图2F。
[0095] 在伤害处理下，GmNF-YA15的表达量无显著的变化趋势，见图2G。
[0096] 二、GmNF_YA17亚细胞定位分析
[0097] 1、材料准备：
[0098] 在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，撕下后内表面朝上，平铺于MS培养基中心， 直径在3cm范围内，25°C预培养4h。
[0099] 2、金粉的处理：
[0100] 取IOOmg直径为1. 0μ M的金粉放入I. 5ml离心管中，加入1ml无水乙醇，充分振 荡3min，以12000rpm离心Imin,去上清，再加入1ml无菌水充分混匀后，以12000rpm离心， 重复上述步骤3次。最后，将金粉悬浮于Iml超纯水中，一 20°C保存备用。
[0101] 3、亚细胞定位重组载体的构建
[0102] ①根据GmNF-YA15基因的序列设计引物GmNF-YA15-BI和GmNF-YA15-XI，引物末端 分别引入PstI和BamHI酶切位点。
[0103] GFP-GmNF-YA15F :5'-AAACTGCAGATGCAGTCCAAGTCT-3'
[0104] GFP-GmNF-YA15R :5'-CGCGGATCCATTGTGGTTCAGCTGCTGA-3'。
[0105] ②用限制性内切酶PstI和BamHI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收1026bp (请提供）的酶切产物；用限制性内切酶PstI和BamHI酶切表达载体16318GFP，回收大约 4kbp (请提供）的载体骨架；
[0106] ③将步骤②的酶切产物和步骤的载体骨架连接；
[0107] ④将步骤③的连接产物冻融法转化大肠杆菌菌株(购自Tiangen公司），37°C过夜 培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0108] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第291-1301位核苷酸所示 的DNA片段插入载体16318GFP的PstI和BamHI酶切位点之间得到的重组载体，命名为 16318GFP-GmNF-YA15。
[0109] 4、制备微粒子弹：
[0110] 3 μ g重组质粒DNA( 16318GFP-GmNF-YA17与16318GFP空载体)分别单独加入直径 为 I. 0 μ M 的金粉悬液 6 μ l(50mg/ml)，0· IM 亚精胺（spermidine)4 μ 1，2· 5M CaCl26 μ 1，将 金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。 12000rpm离心IOs (指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μ 1无水乙醇，粗振荡 后(打散金粉）12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20 μ 1无水乙醇悬浮沉淀，点膜。
[0111] 5、基因枪轰击受体材料：
[0112] ①选用一定压力的可裂膜(本实验用IlOOpsi )，与轰击膜一起，在70%的酒精中浸 泡1~2h，取出晾干；
[0113] ②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；
[0114] ③取20 μ 1上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不 要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；
[0115] ④将上述载体固定圈安装到发射装置上；
[0116] ⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；
[0117] ⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；
[0118] ⑦抽真空指针到26In/Hg ;
[0119] ⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破 开；
[0120] ⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合 体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；
[0121] ⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25°C培养箱中，暗培养16~24h后在激光共聚焦 显微镜下观察。
[0122] 6、洋葱表皮细胞镜检：
[0123] 将基因枪轰击、暗培养16_24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微 镜（Bio-Rad MicroRadiance) (Laser scanning confocal microscopy, LSMC)观察 GFP (绿 色荧光蛋白）荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex=488nm，Em=525±15nm， Power=10%，Zoom7,中速扫描，Frame512X512。软件为 ??ΜΕ-COURSE 和 PH0T0SH0P5. 0。
[0124] 结果如图3所示，A :GmNF-YA17定位于细胞核中；B :16318hGFP空载体对照；定位 于细胞膜与核中。
[0125] 实施例2、GmNF_YA17作为转录因子中的应用
[0126] 用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如下：将CCAAT顺式作用 元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-Ι载体和pLacZi载体的基本启动子 Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因（His3、LacZ和URA3)。当连 接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP (不含激活功能)分别转化到连有CCAAT 顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作 用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞 中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能， 激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激 活功能。
[0127] 表达载体YEP-GAP:中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文 献 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcription factors, DREBland DREB2, with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively, in Arabidopsis, Plant Celll998Aug;10(8):1391-1406。
[0128] Yro液体培养基：细菌培养用酵母抽提物（BactO-Yeast Extract) 10g/L，细菌培 养用胰化蛋白胨（Bacto-Peptone) 20g/L，调节pH至5. 8,121°C /15min灭菌，降至60°C以 后加入40%的Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0129] SD/His-/Ura_/Trp-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源（Yeast nitrogen base) 6.7g/L，营养缺陷型混合物（drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，琼脂粉 (Bacteriological agar)20g/L，调节 pH 至 5. 8,121°C /15min 灭菌，降至 60°C后加入 40% Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0130] 营养缺陷型混合物（Drop-out mix) : (10X ) :L_Isoleucine (异亮氨酸）300mg/L， L-Valine (纟颜氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺噪呤)200mg/L，L-Arginine (精氨酸)200mg/L, L-Histidine Hcl monohydrate (组氨酸)200mg/L，L-Leucine (亮氨酸）1000mg/L，L-Lysine Hcl (赖氨酸）3〇Omg/L，L-Methionine (甲硫氨酸）2〇Omg/L，L-Phenylalanine (苯丙氨酸） 500mg/L，L-Threonine (苏氛酸）2000mg/L，L-Tyrosine (酿氛酸）300mg/L。
[0131] lXPEG/LiAc ：50% PEG33508ml, IOXTE bufferlml, 10XLiAclml0
[0132] IOXTE Buffer :100mM Tris-Hcl, IOmM EDTA、pH=7. 5,121°C高压灭菌，室温保存。
[0133] ΙΧΤΕ/LiAc :10XTE bufferlml，lOXLiAclml，ddH208ml。
[0134] Z Buffer =Na2HPO4 · 7H2016. lg/L, NaH2PO4 · H205. 5g/L, KC10. 75g/L, MgSO4 · 7H200. 246g/L，调节 pH 至 7. 0，121