°C /15min 灭菌，4°C保存。
[0135] X-gal 储存液（X-gal Stock Solution):用 N, N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20°C贮存。
[0136] 含有 X-gal 的 Z buffer 缓冲液 100ml (Z buffer with X-gal)，现用现配：Z buffer98ml, β-疏基乙醇（β-mercaptoethanol) 0.27ml，X-gal 储存液（X-gal stock solution) L 67ml〇
[0137] IOXLiAc :100Mm Tris-Hcl, IOOmM EDTA，pH=7. 5。121°C高压灭菌、室温保存。
[0138] -、重组载体的构建
[0139] I、GmNF-YA 17 基因的获得
[0140] 根据GmNF-YA17基因的序列设计引物GmNF-YA17-BI和GmNF-YA17-XI，引物末端分 别引入BamHI和XhoI酶切位点。
[0141] GmNF-YA17-BI :5'-CGCGGATCCATGCAGTCCAAGT-3' ；
[0142] GmNF-YA17-XI :5'-CCGCTCGAGTCAATTGTGG TTCAGCTG-3'·
[0143] 以大豆品种铁丰8号的整个植株的cDNA为模板，用引物GmNF-YA17-BI和 GmNF-YA17 - XI 进行 PCR 扩增。
[0144] 得到1052bp左右的PCR扩增产物。
[0145] 回收PCR扩增产物。
[0146] 2、重组载体的构建
[0147] ①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收的PCR扩增产物，回收1029bp 的酶切产物；
[0148] ②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收bp的载体骨架；
[0149] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0150] ④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(购自Clontech公司），37°C过夜培 养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序；
[0151] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端291位-1301位核苷酸所示 的DNA片段插入载体YEP-GAP的BamHI和Xho I酶切位点之间得到的重组载体，命名为 YEP-GAP-GmNF-YAl7。
[0152] 二、GmNF_YA17的体内结合特异性和激活特性的验证
[0153] 1、酵母报道子的构建
[0154] (1)正常双重酵母报道子的构建
[0155] DNA 片段 A (含 4 个 CCAAT 元件）：
[0156] 5' -GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3' 。
[0157] 将 DNA 片段 A 构建到 pHis-1 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）的Pminms3启动子上游，得到重组载体pHis-1-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶将 pHi s-1-CCAAT载体切成线状。
[0158] 将 DNA 片段 A 构建到 pLacZi 载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司）PCTa启动子上游，得到重组载体pLacZi-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶分别将 PLacZi-CCAAT载体切成线状。
[0159] 先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞（YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech公司）内，获得能在SD/His-培养基上正常生长的酵母转化子 (Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复CCAAT 元件的线状PLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培养基 上，选择获得含有PHis-I-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。
[0160] (2)突变体双重酵母报道子的构建
[0161] DNA 片段 B (含 4 个 CCAAT 元件的突变体 TTTTA) : 5 ' -GAATTC-TTTTA-TTTTA-TTTTA-TTTTA-GTCGAC-3' 。
[0162] 用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤（1)，得到突变体双重酵母报道子。
[0163] 2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析
[0164] ⑴分别接种上述1获得的含有pHis-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报 道子和突变体双重酵母报道子到Iml Yro液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬 浮液转至含有50ml YH)液体培养基的三角瓶中，30°C /250rpm摇过夜，测0D600=1. 7-1. 8 (计数约4X107个/mL);
[0165] ⑵取30ml步骤（1)过夜培养物接到300ml新鲜的YH)培养基中，30°C /250rpm培 养，约3小时（至0D600=0. 5±0. 1)，室温1000 g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积 I X TE 悬浮，1000g/5min 离心；
[0166] ⑶吸弃上清，用I. 5ml新鲜配制的I X TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；
[0167] ⑷取出0.1 ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0. 1 μ g由一制备的重组载 体 YEP-GAP-GmNF-YA17、0.1 mg ssDNA (鲑鱼精 DNA，SiTaa)、0. 6mlPEG/LiAc 高速振荡 1 分 钟，30°C /200rpm振荡培养30分钟；
[0168] (5)加入70ul DMSO (siTaa#D8779)，轻轻倒置混匀，42°C热激30分钟，其间轻轻振 荡，冰浴2分钟，室温1000 g离心5min ;
[0169] (6)吸弃上清，加入0· 5mllXTE buffer悬浮细胞；
[0170] (7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L3_AT的SD/His7Ura7Trp -选择 性培养基上画线培养。
[0171] ⑶平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以 便做对照分析。
[0172] (9)颠倒放置于培养箱中，30°C培养3 - 4天。
[0173] (1Φ结果发现在0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp-的培养基平板上正常的酵母 报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/ L3-AT的SD/HiS_/Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母 报道子被抑止没有生长。
[0174] 3、半乳糖苷酶活性检测
[0175] ⑴从0mmol/L3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上分别挑取正常的酵母报 道子和突变的酵母报道子菌落。转至Yro液体培养基中，于3〇°c振荡培养，待长至对数生长 后期，取I. 5ml菌液，3000rpm离心30s ;
[0176] ⑵弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻lOmin，取出使其自然融解，加 50ul Z/X-gal溶液，30°C温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母 报道子在12h内没有变化，仍为白色。
[0177] 说明转录因子GmNF_YA17能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了 GmNF-YA17的体内结合特异性和激活功能，为 转录因子。
[0178] 实施例3、GmNF_YA17在提高植物的耐逆性中的应用
[0179] 一、转GmNF_YA17拟南芥的获得
[0180] 1、重组载体的构建
[0181] l)GmNF_YA17 基因的克隆
[0182] 根据 GmNF-YA 17 基因的序列设计引物对（GmNF-YA17-12IF 和 GmNF-YA17-121R)，弓丨 物末端分别引入Sma I和SacI酶切识别位点，
[0183] GmNF-YA17-121F :5' -TCCCCCGGGATGCAGTCCAAGTCTGAAAC-3'
[0184] GmNF-YA17-121R :5' -TACGAGCTCTCAATTGTGGTTCAGCTGCT-3'
[0185] 以大豆属大豆（Glycine max L.)(铁丰8号）cDNA为模板，用GmNF-YA17-121F和 GmNF-YA17-121R进行PCR扩增，得到大小约IKb的PCR产物（GmNF-YA17基因）。
[0186] 回收上述PCR产物。
[0187] 2)、重组载体的构建
[0188] ①用限制性内切酶Sma I和SacI酶切步骤1回收的PCR产物，回收1029bp酶切 产物；
[0189] ②用限制性内切酶sma I和SacI酶切pBI121(Clontech公司购买)，回收1029bp 载体骨架；
[0190] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0191] ④将步骤③的连接产物电击转化TOPlO菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养， 挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
[0192] 测序结果表明，质粒为将序列表的序列2自5'端第291-1301位核苷酸所示 的DNA片段插入载体pBI121的Sma I和SacI酶切位点之间得到的重组载体，命名为 pBI12I-GmNF-YAl7。
[0193] 3、重组农杆菌的获得
[0194] 用重组质粒pBI121-GmNF-YA17基因转化农杆菌C