58C1 (北京拜尔迪生物 技术公司购买)，得到重组农杆菌058(：1/?81121-6111即-￥417(提取质粒送去测序，为 pB1121-GmNF-YA17，则含有该质粒的重组菌为阳性)。
[0195] 4、转GmNF_YA17拟南芥获得
[0196] 1)将3得到的重组农杆菌接种于LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉 素，50mg/ml庆大霉素）液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时，得到菌液；
[0197] 2)将菌液转至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素） 中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3. 0);
[0198] 3)收集菌体，4 °C、4000g离心10min，用含10%蔗糖MS液体培养基(含 0· 02%silwet)稀释至 0D600 约为 0· 8-1. O ;
[0199] 4)将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-O, SALK公司购买，也称为野生型拟南芥）整株 与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆， 侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养， 收获T 1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50 μ g/L卡那霉素)阳性植株为T1代再生植株，传代， 直到得到T3代再生植株。
[0200] T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T 2代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
[0201] 提取T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用引物对： F: 5' -TGAGGGCTCAAACCACTTAG ;R: 5' -TCAATTGTGGTTCAGCTGCTGA-3' ；进行 PCR 扩增，部分样 本结果如图4A所示，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0, L1-L2 为T3代再生植株，H为H20。得到300bp为阳性。
[0202] 提取T3代再生植株的整个植株的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物对： F: 5' -TGAGGGCTCAAACCACTTAG ;R: 5' -TCAATTGTGGTTCAGCTGCTGA-3 ;进行 PCR 扩增。
[0203] 部分样本的结果见图4B，P为Plasmid, M为Marker, C为哥伦比亚生态型拟南芥 Col-0, L1-L2为T3代再生植株，H为H20。得到大小为300bp片段的为阳性。
[0204] 上述DNA和cDNA水平上鉴定均为阳性的即为T3代转GmNF-YA17拟南芥。
[0205] 采用同样的方法将质粒PBI121转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，培育 获得T 3代转空载体拟南芥，采用同样的方法鉴定，未得到915bp片段。
[0206] 二、转基因植物的耐逆性鉴定
[0207] 1、耐旱性鉴定
[0208] 为评价过表达GmNF_YA17因植株种子苗期抗氧化性地效果。
[0209] 将T3代转GmNF-YA17拟南芥株系GmNF-YA17-l、GmNF-YA17-2、T3代转空载体拟南 芥和野生型拟南芥(WT)种子萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎(不浇水2周 时)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。设置三次重复实验，结果取平均值。
[0210] 照片见图5，A :干旱处理前野生型与转基因植株；B:干旱处理15天复水一周后的 野生型与转基因植株。
[0211] 野生型拟南芥（WT)的存活率为15. 9% ;
[0212] GmNF-YA17_l 的存活率为 77. 4% ;
[0213] GmNF-YA17_2 的存活率为 77. 6% ;
[0214] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0215] 可以看出，干旱处理后，转基因植株存活率高于野生型拟南芥，说明基因 GmNF-YA17具有耐旱性。
[0216] 2、耐盐性鉴定
[0217] 分别将 T3 代转 GmNF-YA17 拟南芥株系 GmNF-YA17-l、GmNF-YA17-2、GmNF-YA17-3、 T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果 取平均值。
[0218] 将 T3 代转 GmNF-YA17 拟南芥株系 GmNF-YA17-l、GmNF-YA17-2、GmNF-YA17-3、T3 代 转空载体拟南芥和野生型拟南芥（WT)种子萌发15天的幼苗浇灌IOOmM NaCl水溶液，直至 野生型植株叶片出现萎蔫变黄，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。
[0219] 照片见图6, A :高盐处理前野生型与转基因植株；B: IOOmMNaCl处理15天复水一 周后的野生型与转基因植株。
[0220] 野生型拟南芥（WT)的存活率为32. 5% ;
[0221] GmNF-YA17_l 的存活率为 82. 7% ;
[0222] GmNF-YA17_2 的存活率为 82. 8% ;
[0223] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0224] 可以看出，高盐处理后，转基因植株存活率高于野生型拟南芥，说明基因 GmNF-YA17具有耐盐性。
[0225] 2、抗氧化性鉴定
[0226] 为评价过表达GmNF-YA17因植株种子苗期抗氧化性地效果。将T3代转GmNF-YA17 拟南芥株系GmNF-YA17-l、GmNF-YA17-2、T 3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥(WT)种子(各 60株）进行抗氧化性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。
[0227] T3代转GmNF-YA17拟南芥株系GmNF-YA17-l、GmNF-YA17-2、T3代转空载体拟南芥 和野生型拟南芥种子萌发4d后挑取生长状态一致的幼苗，转移到含有IOmM H2O2的1/2MS 培养基上坚直培养14d。观察表型、拍照并统计主根长。
[0228] 照片见图7, A :抗氧化处理前野生型与转基因植株；B: IOmM H2O2处理14天后的野 生型与转基因植株。
[0229] 野生型拟南芥Col-O的主根长为3. 04cm ;
[0230] GmNF-YA17-l 的主根长为 6. 25cm ;
[0231] GmNF-YA17-2 的主根长为 6. 22cm ;
[0232] T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0233] 可以看出，H2O2处理后，转基因植株主根长度大于野生型拟南芥，说明基因 GmNF-YA 17具有抗氧化性。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与植物耐逆性和/或抗氧化性相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1) -4)中任一 种DNA分子： 1) 编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子； 2) 编码区为序列2自5'末端第291至1301位核苷酸所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或抗氧化性相关蛋 白的DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性和/或抗氧化性相 关蛋白的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体，得到表达权利要 求1所述蛋白质的载体。5. 扩增权利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物对。6. 权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性或调节植物抗氧化性中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物中，得 到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性和/或抗氧化性高于所述目的植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述DNA分子通过权利 要求4所述重组载体导入所述目的植物； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性； 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。10. 权利要求1所述蛋白作为转录因子的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YA17及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆得到基因GmNF-YA17，其在干旱、盐、ABA和乙烯的诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核上，并且可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件的基因的转录表达。本发明的GmNF-YA17可以提高植物的抗旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/11, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104892741
【申请号】CN201410079128
【发明人】徐兆师, 马有志, 冯志娟, 郑炜君, 陈明, 李连城
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日