化合物pac-1或其盐及包含它们的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学技术领域，具体涉及ZYS-I (无定形形式的PAC-1)的制备方 法、以及包含它的药物组合物及其制药用途。 技术背景
[0002] 肿瘤是危害人类健康头号杀手，其中恶性肿瘤死亡率位居全部死亡疾病之首。 二十世纪中叶以来，人类在肿瘤防治方面投入大量的人力和物力，但其危害仍未能得到有 效的控制，其发病率和死亡率仍呈逐年上升趋势。目前肿瘤治疗的三大手段是化疗、放疗及 手术治疗，其中化疗是主要手段。随着抗肿瘤药物的不断开发和合理应用，化疗在恶性肿瘤 的治疗中占有越来越重要的地位，并呈现从姑息性治疗向根治性治疗的发展趋势。目前常 用的抗肿瘤药包括细胞毒类药物、激素药、分子靶向治疗药、生物反应调节剂、肿瘤分化诱 导剂、肿瘤血管生成抑制剂以及辅助治疗肿瘤的药物等。其中最常见的是细胞毒类药物，但 它在具备高效的同时，也存在毒副反应大、缺乏选择性等缺点。近年来，随着对肿瘤特性和 本质的研究深入，抗肿瘤药物治疗正从传统的细胞毒性药物治疗，向针对细胞受体、关键基 因和调控分子为靶点的治疗方向发展；抗肿瘤药物临床疗效评价指标也从以往的追求肿瘤 瘤体的实质性缩小向延长患者的生存期和/或提高生存质量的转变。而PAC-I正是符合这 一发展趋势的靶向型小分子抗肿瘤药物。
[0003] PAC-I是美国伊利诺伊大学Quinn P. Peterson教授在对20000多种化合物进行 体外筛选中，发现的第一个能够直接激活半胱天冬酶-3酶原（procaspasse-3)的小分子 化合物，命名为 PAC-1，化学名称是 1-Piperazineacetic acid, 4_(phenylmethyl)_2_[[ 2-hydroxy-3-(2-propen-1-yl)phenyl]methylene],结构如式（I)。研究证明，PAC-1 能 够选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，且其诱导凋亡作用与细胞内的procaspasse-3水平呈 正相关，而正常细胞的procaspasse-3含量较低，对其杀伤能力就较小，具备了较好的选 择性。其作用机理经过研究，证明主要是通过螯合抑制锌离子，使procaspasse-3自体活 化为 caspase-3,诱导细胞凋亡（Quinn P，et al.，J Mol Biol，2009,388(l):144-158.; Peterson QP，et al. J Med Chem, 2009, 52 (18) :5721-5731.),同时它对多种肿瘤细胞均 具有诱导凋亡的作用，且与caspase-3酶原表达呈正相关（Roy S，et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001，98(11) :6132-6137.)。近期亦有研究显示，高浓度的PAC-1能够从内质 网细胞凋亡途径诱导细胞凋亡，表现出独特细胞凋亡的作用特点（West DC，et al.Mol Pharm. 2012, 9(5):1425-1434)。
[0004]
[0005] 中国专利公开CN101184491A及美国专利公开US2007/0049602A1向大众公开第一 个直接激活procaspasse-3的小分子化合物PAC-I，并要求保护PAC-I、PAC-I衍生物文库 化合物，包括具有ZZ式、ZZ2式、ZZ3式、ZZ4式的相关化合物及其合成方法；同时对其在癌 细胞中选择性诱导细胞凋亡的方法、体外及细胞内直接筛选能修饰procaspasse-3分子的 化合物的方法、鉴定或判断癌细胞对于半胱天冬蛋白酶酶原活化化合物处理的潜在敏感性 的方法、一种通过鉴定候选癌症患者体内半胱天冬酶原的升高水平来筛选可适用于半胱天 冬酶原活化剂治疗的所述候选者的方法进行了保护。国际专利W02010/091382A1对PAC-I、 无神经毒性化合物S-PAC-I及其类似物进行保护。
[0006] 目前文献报道的PAC-I均是晶体形式。而且，文献报道称已有的PAC-I的晶体形 式具有较强的神经毒性（参见 Q P. Peterson, D C. Hsu, C J. Novotny, et al. Discovery and Canine Preclinical Assessment of a Nontoxic Procaspase-3 - Activating Compound, Cancer Res2010; 70:7232-7241)，这导致PAC-I开发成药物的前景并不被人看好，例如，其 发现者Quinn P. Peterson教授就已经转向了毒性低的PAC-I类似物S-PAC-I的开发。
【发明内容】
[0007] 本发明人为解决PAC-I的神经毒性强、在作为药物的应用中受到限制的技术问题 进行了深入研究，结果制备得到无定形形式的PAC-1，并发现与已有的PAC-I晶体相比，无 定形形式的PAC-I的神经毒性显著降低，从而完成了本发明。
[0008] SP，本发明如下。
[0009] 1.下述式（I)表示的化合物PAC-I，其为无定形形式：
[0010]
[0011] 2. -种口服药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的化合物PAC-1， 以及药学上可接受的载体。
[0012] 3.根据权利要求2所述的口服药物组合物，其为片剂、胶囊剂、滴丸剂或丸剂。
[0013] 4.根据权利要求2或3所述的口服药物组合物，其还包含PAC-I或其盐的晶体形 式，且相对于PAC-I或其盐的晶体形式与PAC-I的无定形形式的总量，PAC-I的无定形形式 的含量为10重量％以上，优选50重量％以上、更优选80重量％以上、更优选90重量％以 上、更优选95重量％以上、更优选97重量％以上、更优选99重量％以上。
[0014] 5.根据权利要求2~4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合 物用于肿瘤、优选转移性肿瘤的治疗。
[0015] 6.根据权利要求2~4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合 物用于抑制肿瘤转移。
[0016] 7.权利要求1所述的化合物PAC-I的无定形形式在制备口服药物组合物中的用 途。
[0017] 8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于肿瘤、优选转移性 肿瘤的治疗。
[0018] 9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于抑制肿瘤转移。
[0019] 根据本发明，无定形形式的PAC-I显示出明显低于PAC-I晶体的神经毒性，因此更 适合开发成药物来治疗例如肿瘤、特别是转移性肿瘤等疾病。
【附图说明】
[0020] 图I. PAC-I及其类似物的化学结构。
[0021] 图2. PAC-I针晶与ZYS-I的显微镜照片对比。
[0022] 图3. PAC-I针晶与ZYS-I的扫描电镜照片对比。
[0023] 图4. PAC-I针晶与ZYS-I的X射线衍射结果对比。其中，图4a为PAC-I针晶的X 射线衍射结果，图4b为ZYS-I的X射线衍射结果。
[0024] 图5. ZYS-I与PAC-I针晶对HGC-27细胞增殖的影响
[0025] 图6. ZYS-I与PAC-I针晶对K562/A02细胞增殖的影响
[0026] 图7. ZYS-I与PAC-I针晶对A549细胞增殖的影响
[0027] 图8. ZYS-I与PAC-I针晶对HT-1080细胞增殖的影响
[0028] 图9.不同剂量ZYS-I对HGC-27细胞二维迁移的影响(细胞划痕实验）
[0029] 图10.不同剂量ZYS-I对HGC-27和HT-1080细胞三维迁移的影响（Transwell实 验）
[0030] 图11.不同剂量ZYS-I对HT-1080细胞侵袭的影响（Transwell实验）
[0031] 图12. ZYS-I对HUVEC细胞增殖及小管生成的影响。A :ZYS-1对HUVEC细胞增殖 的影响；B、C :ZYS-1对小管生成的影响。
[0032] 图 13.不同剂量 ZYS-I 对 Caspase-3, NF-κ B, VEGF，IXAP 蛋白表达的影响。
【具体实施方式】
[0033] 在不与本说明书中的定义发生冲突的情况下，本说明书中的术语具有本领域技术 人员通常理解的含义，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
[0034] PAC-I
[0035] 在本说明书中，PAC-I是指一种能够直接激活半胱天冬酶-3酶原（Procaspase-3) 的小分子化合物，其化学名称是1-?1口6四2；11163061：；[。3(^(1，4-&116117111161：1171)-2-[[2-hydroxy-3-(2-propen-1-yl) phenyl] methylene] ((E)-Ν' -(3_ 烯丙基 _2_ 羟基苯亚甲 基）-2-(4-苄基哌嗪-1-基）乙酰肼)，结构如式（I)，其被认为能够选择性诱导肿瘤细胞发 生凋亡，因而能够作为抗肿瘤药物。
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[0037] 无定形形式的PAC-I
[0038] 现有技术中报道的PAC-I均以晶体形式存在，且具有较强的神经毒性，这在很大 程度上限制了 PAC-I作为药物的应用。本发明人意外地发现，无定形形式的PAC-I显示出 明显低于PAC-I晶体的神经毒性。需要说明的是，通常来说，无定形态的药物相对晶型药物 具有更高的分散性，因而更有利于药物的吸收，相应地表现出的毒性也应更强，但在本发明 中，意外地发现无定形态的PAC-I (即ZYS-1)却表现出更低的毒性。因此，无定形形式的 PAC-I的低神经毒性是本领域技术人员无法依据现有技术预料得到的技术效果。
[0039] 在说明书中，无定形形式的PAC-I也称为ZYS-I，ZYS-I具有典型的无定形物质的 特征--无明显的X射线衍射峰。与此相对，在一些情况下，本说明书中的PAC-I也用来特 指PAC-I晶体。
[0040] 所述ZYS-I可以采用例如下述方法来制备，但其制备方法不限于此。所述方法包 括：
[0041] 步骤（1):将PAC-I的晶体溶于有机溶剂中，得到PAC-I的第一溶液；
[0042] 步骤（2):在搅拌下，向步骤（1)中所得的PAC-I的溶液中加入水，得到PAC-I的第 二溶液；
[0043] 步骤（3):持续搅拌，待析出的固体呈白色或乳白色时，过滤，除去溶剂，得到析出 物；
[0044] 步骤（4):对所得析出物进行干燥，得到无定形形式的PAC-1。
[0045] 步骤⑴中，相对于PAC-I的晶体lg，有机溶剂用量可以是例如1~20mL，优选 2~10mL，更优选4~6mL。可以采用超声波处理、搅拌、振荡等手段来促进PAC-I晶体的溶 解。所述有机溶剂可以是例如选自无水乙醇、95%乙醇、乙腈、乙