一种基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁珠法高效富集空气介质微生物的 方法。
【背景技术】
[0002] 自1943年美国实施"气溶胶感染"计划以来，国内外便开始广泛关注微生物气溶 胶。微生物气溶胶中的细菌包括非病原菌、致病菌及条件性致病菌，它们在一定程度上均可 通过空气传播导致人体感染，甚至极少量的致病菌就可直接导致呼吸道的感染。因此，加强 与人类密切相关的气溶胶微生物研宄对控制人类健康风险至关重要。
[0003]目前，空气微生物常用检测方法可分为培养法和非培养法两类。传统培养法利用 选择性培养基进行微生物分离培养，由于空气微生物种类繁多，且空气微生物可培养性很 低，不到1%，使空气微生物信息研宄受到极大的限制。非培养法以环境样品中的微生物基 因组DNA研宄为基础，其中，DGGE、TGGE、qPCR、T-RFLP和高通量测序技术均为基于分子生 物学的传统分析技术，可通过PCR扩增及分子指纹技术，快速对微生物群落结构进行比较 和检测。然而，研宄表明相比于土壤、粪便和水中的微生物基因组DNA含量，空气中含量较 低，更难于富集，采集的效率低，而检测技术对微生物的要求较高，对采集过程、处理过程和 检测过程都需要做严格控制才能得到有效的分析结果。
【发明内容】
[0004] 针对空气介质微生物难以富集的技术问题，本发明提供了一种基于磁珠法高效富 集空气介质微生物的方法，可在低成本前提下获得高富集量、高浓度、便于检测的空气介质 微生物，有效的解决了空气介质微生物监测和分析过程中难追踪、难富集、难定量的问题。
[0005] 对此，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤A:将滤膜放置到待测环境中进行吸附采样，将采样后的滤膜放入到提取容 器中；
[0008] 步骤B:将酸性缓冲溶液加入到步骤A的提取容器中，然后振荡5~lOmin，
[0009] 步骤C:将提取容器放到超声分散设备中进行超声分散10~20min;
[0010] 步骤D:往提取容器中加入四氧化三铁磁珠，继续超声分散10~30s;
[0011] 步骤E:另取一分离用容器，加入所述酸性缓冲溶液，然后将步骤D超声分散后的 提取容器中的液体倒入其中，振荡混合均匀后静置1~lOmin，再进行磁珠分离，得到分离 的磁珠；
[0012] 其中，所述酸性缓冲溶液的pH值为2. 0~2. 5。
[0013] 发明人通过创造性的试验研宄，意外的发现酸性环境更有利于空气介质微生物的 富集，采用此技术方案，有利于获得高浓度、便于检测的空气介质微生物，有效的解决了空 气介质微生物监测和分析过程中难追踪、难富集、难定量的问题。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述酸性缓冲溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液或 PBS磷酸盐缓冲液中的任意一种。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤D中，所述四氧化三铁磁珠的粒径为100~400nm。
[0016] 作为本发明的进一步改进，步骤E中，所述磁珠分离包括：用石蜡封口膜将磁铁封 包住，用镊子夹住后放置于上述烧杯溶液中进行搅拌以吸附尽可能多的磁珠；另取50mL离 心管将封口膜撕下放入离心管中，加入30mL无菌生理盐水，超声振荡40~60s后将封口膜 夹出，将剩余液离心12min，转速5000r/min，倒掉上清液后将管内磁珠转移到干净离心管 中备用，得到分离的磁珠。
[0017] 作为本发明的进一步改进，所述无菌生理盐水的浓度为0.9 %生理盐水，并在 121°C下灭菌 20min。
[0018] 作为本发明的进一步改进，步骤E中，所述磁珠分离的方法为：将所述分离用容器 放在磁力架上，进行一次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，得到分离的磁珠。
[0019] 作为本发明的进一步改进，步骤B中，所述振荡的设备的转速为2800~3000r/ min〇
[0020] 作为本发明的进一步改进，步骤C中，将提取容器放在装有冰水混合物的烧杯中， 超声4min，停顿3min，重复操作三次。
[0021] 作为本发明的进一步改进，步骤E中加入的酸性缓冲溶液的量不小于步骤B中加 入的酸性缓冲溶液的量。
[0022] 进一步优选的一种基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法，包括如下步骤：
[0023] (1)剪碎采样滤膜置于烧杯，用镊子小心撕揭滤膜正面吸附层并放置于50mL离心 管中；
[0024] (2)加入酸性缓冲溶液40mL;
[0025] (3)离心管放置于振荡器，调节振荡器转速至2800~3000r/min，振荡5~lOmin;
[0026] (4)将上述离心管放置于装有冰水混合物的250mL烧杯中，超声4min，停顿3min， 连续操作三次；
[0027] (5)往离心管中投加25mg粒径200nm的四氧化三铁，超声20s使其分散均匀；
[0028] (6)另取500mL烧杯投加50mL相同酸性缓冲溶液，后将离心管内的液体倒入烧杯 中，振荡混合均匀后静置3min;
[0029] (7)用石蜡封口膜将磁铁封包住，用镊子夹住后放置于上述烧杯溶液中进行搅拌 直至吸附最多磁珠；
[0030] (8)另取50mL离心管将封口膜撕下放入离心管中，加入30mL无菌生理盐水，超声 振荡40~60s后将封口膜夹出；
[0031] (9)将剩余液离心12min，转速5000r/min，倒掉上清液后将管内磁珠转移到干净 离心管中备用。
[0032] 其中，所述酸性缓冲溶液的pH值为2. 0~2. 5,所述酸性缓冲溶液为柠檬酸-磷酸 氢二钠缓冲液或PBS磷酸盐缓冲液中的任意一种。
[0033] 本发明还提供了一种基于磁珠法提取空气介质微生物基因组DNA的方法，采用如 上所述的基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法采集微生物得到吸附了微生物的磁 珠，然后对磁珠吸附的微生物进行基因组DNA的提取。
[0034] 与现有技术相比，采用本发明的技术方案，在酸性条件下可高效富集空气介质微 生物，可在低成本前提下获得高回收率、高浓度、便于检测的空气介质微生物，极大提高了 空气介质微生物的检测限，有效的解决了空气介质微生物监测和分析过程中难追踪、难富 集、难定量的问题；适用于准确、方便、快捷地分析监测空气介质微生物特征研宄。
[0035] 采用本发明基于磁珠技术，在酸性条件下可高效富集空气介质微生物，可用于定 性定量PCR、荧光细菌染色、特征菌的分离与扩大培养、特征菌的试纸检测等。其中重要的应 用是用于提取高浓度、高质量的空气介质微生物基因组DNA，全面分析空气介质微生物种群 特征，并为分析空气介质微生物特征基因、目标片段等一切基于DNA产物研宄提供了强有 力的底物保障，该方法的富集效应将空气介质微生物的研宄边界延伸至痕量，大大提高了 空气介质微生物的检测限。
【附图说明】
[0036] 图1是本发明一种实施例基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法的过程示 意图；
[0037] 图2是本发明一种实施例的焚光分光光度法标准曲线图；
[0038] 图3是本发明另一种实施例的定量验证烟雾仓装置示意图；
[0039] 图4为本发明另一种实施例的荧光染色计数图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0041] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0042] 实施例1 :
[0043] 如图1所示，一种基于磁珠法高效富集空气介质微生物的方法，具体包括以下步 骤：
[0044] A:空气介质微生物采集
[0045] (1)采样设备：青岛崂山应用技术研宄所生产的大流量TSP(PMIO)采样器，采集空 气样收集到一张230mmX180mm玻璃纤维膜滤膜上；
[0046] (2)采样时长：10h，最大采集流量为1. 05m3/h;
[0047] (3)采样地点：养鸡厂。
[0048] B:采用磁珠法富集空气介质微生物
[0049] (1)剪碎采样滤膜置于烧杯中，取1/4大小滤膜并用镊子小心撕揭滤膜正面吸附 层分别放置于3个50mL离心管中；
[0050] (2)往3个离心管中投加柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，分别调节pH值为2. 2、 7. 2、10. 0,即为酸性、中性、碱性；
[0051] (3)离心管放置于振荡器，调节振荡器速率至3000r/min，振荡lOmin;
[0052] (4)将上述离心管放置于装有冰水混合物的250mL烧杯中，超声4min，停顿3min， 连续操作三次；
[0053] (5)分别往离心管中投加25mg粒径为200nm纳米四氧化三铁，超声20s使其分散 均匀；
[0054] (6)另取500mL烧杯投加50mL相同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，后将离 心管内的液体倒入相应烧杯中，振荡混合均匀后静置3min;
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