1、 本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，能够检测鲤春病毒 血症病毒欧洲株和亚洲株，检测范围广，能有效检测进化距离很远的不同鲤春病毒血症病 毒毒株； 2、 本发明与已有检测方法相比，灵敏性高，在标准品为4X107-40拷贝范围内都有极好 的线性关系，检测范围可达7个数量级，可以高效检测出鲤春病毒血症病毒病鱼组织以及 无临床症状的病毒携带鱼，提尚了检测效率； 3、 本方法可实现准确定量，通过制备标准品并绘制标准曲线，根据待测样品的Ct值， 与标准曲线对照，可定量计算病毒拷贝数，并且本方法比基于G基因的检测方法更为灵敏， 使得检测结果更加准确； 4、 本发明方法特异性强，检测引物和探针与鲤春病毒血症病毒特异性结合，与其他水 生病毒，如传染性脾肾坏死病毒ISKNV，锦鲤疱疹病毒KHV，草鱼呼肠孤病毒GCRV，对虾白斑 综合征病毒WSSV和传染性皮下及造血器官坏死病毒IHHNV都没有交叉反应。
【附图说明】
[0011] 图1.本发明的利用新型引物和TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤春病毒血症 病毒欧洲株和亚洲株感染细胞样品的扩增曲线图谱，A:欧洲标准株SVCV10/3感染的细胞 样品；B:SVCV-265、SH140501、SH140502、SH140503 和SH1405022 5 株亚洲株病毒感染的细 胞样品；C:空白对照。
[0012] 图2.本发明的利用SYBRGREENI实时定量PCR检测6份鲤鱼样品的扩增曲线图 谱，横坐标代表反应循环数，纵坐标代表荧光强度，A:欧洲标准株阳性对照；B:6份鲤鱼样 品。
[0013] 图3.本发明的利用SYBRGREENI实时定量PCR检测鲤鱼样品的熔解曲线图 谱，横坐标代表熔解温度，纵坐标代表荧光信号导数，A:欧洲标准株阳性对照；B:为6份 鲤鱼样品，熔解曲线的峰值对应的温度即为Tm值，阳性对照及待测样品的Tm值均为 79.17±0.01。C0
[0014] 图4.本发明的利用N基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩 增曲线图谱，从左到右依次为肾、脾、肌肉、肝、脑和精巢组织。
[0015] 图5.采用鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T1152-2011中的G基因TaqMan荧光 探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱，从左到右同样依次为肾、脾、肌肉、 肝、脑和精巢组织。
[0016] 图6.本发明的不同浓度的鲤春病毒血症病毒标准品的实时荧光定量PCR反应的 扩增曲线图谱，横坐标代表反应循环数，纵坐标代表荧光信号强度，1-7:PCR反应体系中加 入标准品浓度分别为 4X107、4X106、4X105、4X104、4X103、4X102、4XIO1 拷贝。
[0017] 图7.本发明的鲤春病毒血症病毒的实时定量PCR检测方法的标准曲线图 谱，横坐标代表样品的拷贝数，纵坐标代表Ct值，拷贝数X与Ct值y的线性公式为： y=-3. 397x+44. 2,相关系数R2=O. 999。
[0018] 图8.本发明的其他水生病毒的SYBRGREENI实时荧光检测熔解曲线图谱，A:鲤 春病毒血症病毒标准品；B:传染性脾肾坏死病毒（ISKNV)，锦鲤疱疹病毒（KHV)，草鱼呼肠 孤病毒（GCRV)，对虾白斑综合征病毒（WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV)。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例及附图来进一步阐述本发明。
[0020] 实施例1、 以进化距离很远的鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚洲株感染的细胞样品为例，采用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测鲤春病毒血症病毒。
[0021] 上述的设计特异性引物序列和焚光探针序列： 在GenBank数据库中搜索鲤春病毒血症病毒基因序列，利用BioEdit7. 9软件进行基 因序列比对分析，通过BEAST1. 8软件分析比较各基因的进化速率，结果表明，相对于G基 因，鲤春病毒血症病毒的核蛋白N基因更加保守。因此，根据N基因的保守区，利用Primer Express3. 0软件，设计并筛选特异性的引物序列和荧光探针序列，其中，特异性引物序列 包含正向引物和反向引物，荧光探针为TaqMan探针，设计的实时荧光定量PCR特异性引物 序列和探针序列如下： 正向引物：N-TFl:ATCAGGCCGATTATCCTTCCA; 反向引物：N-TRl:AGATAAGCAITCACATGCTGTAT; 荧光探针：N-tagl:5' -FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGACATAITGCCT-TAMRA-3'; 荧光探针通过TAKARA公司的引物标记服务，在荧光探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片段长度为151bp。
[0022] 上述的建立荧光PCR反应体系： 取待测病毒感染的细胞样品200y1，采用常规Trizol法提取样品总RNA。
[0023]米用PrimeScript1ststrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒（TAKARA公司）， 按照说明书操作步骤进行cDNA合成。
[0024] 按技术方案4中TaqMan荧光探针法建立实时定量PCR反应体系。采用ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪进行反应，反应程序为：94°C30s;之后94°C3s、60°C30s40个循环，收集荧光； 结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且Ct< 37. 0,同时扩增曲线为平滑的 "S"型，则可以判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒。本检测中设立鲤春病毒血症病毒欧 洲标准株SVCV10/3、亚洲株SVCV-265、SH140501、SH140502、SH140503 和SH1405022 作为测 试对象，水为空白对照，经检测发现，本发明的特异性引物和探针可以同时扩增鲤春病毒血 症病毒欧洲株以及亚洲株感染的细胞样品，其扩增曲线见图1，所有病毒感染细胞样品均有 扩增。表明本发明的荧光定量PCR检测方法，能够同时检测鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚 洲株，检测范围广，实用性强。
[0025] 实施例2、 以鲤鱼样品为例，采用SYBRGREENI荧光染料法检测鲤春病毒血症病毒。
[0026] 6份待测鲤鱼样品采自上海闵行某养殖场，解剖学表明无任何明显鲤春病毒血症 临床症状，检测是否携带鲤春病毒血症病毒。
[0027] 取30mg待测鲤鱼的肝、脾、肾、脑混合匀浆组织，总RNA提取及cDNA合成同实施 例1，使用的特异性引物及探针序列同实施例1，SYBRGREENI荧光染料法仅需要特异性引 物，不需要荧光探针。
[0028]SYBRGREENI实时定量PCR反应体系及反应程序同技术方案中4所述。采用 7500Fast荧光定量PCR仪进行反应，反应条件为95°C30s;之后95°C5s、60°C30 s、72°C30s进行40个循环，结束后，仪器会立即进行熔解曲线分析，最后通过ABI7500 2. 0. 6软件计算扩增产物Tm值； 上述样品的扩增曲线见图2,反应结束后，仪器自带软件给出上述样品的熔解曲线 见图3,结果表明待测样品扩增曲线呈"S"型，样品的Tm值为79. 17±0. 01°C，介于 78. 5-79. 4°C之间，与阳性对照一致，由此判定6份鲤鱼样品中都包含有鲤春病毒血症病 毒。
[0029] 实施例3、 采用本发明设计的针对N基因的特异性引物和探针与采用鲤春病毒血症检疫技术规 范SN/T1152-2011中的针对G基因的引物和探针的荧光定量PCR检测方法的灵敏性比较。
[0030] 取20条健康鲤鱼进行人工感染实验，病毒接种14天后，将感染鲤鱼的肝、脾、肾、 脑、肌肉、精巢不同组织分别取样，总RNA提取及cDNA合成见同实施例2，使用的N基因的特 异性引物和探针同实施例1。
[0031] 使用的G基因的引物和探针如下： SVCV-GF：ATCATTCAAAGGATTGCATCAG； SVCV-GR：CATATGGCTCTAAATGAACAGAA； SVCV-G-t