ag：FAM-TCCCCCTCAAAGTTGCGGATGG-TRAMA 荧光探针通过TAKARA公司的引物标记服务，在荧光探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片段长度为136bp。
[0032]TaqMan荧光探针法PCR反应体系和程序同实施例1，检测的6种不同鲤鱼组织 样品的扩增曲线见图4和图5,其中图4为采用本发明的N基因TaqMan荧光探针实时定 量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱；图5为采用鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011中的针对G基因的引物和荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线 图谱。
[0033] 为了计算组织样品中病毒拷贝数，从而制作了标准曲线。
[0034] 上述的用于制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线： 利用PrimerExpress3. 0软件，设计N基因的阳性质粒，PCR引物序列为： SVCV-NF：ATCATGAGTGTCATTCGGATC； SVCV-NR:CTTACCCATAGGITTGmTATCC。扩增片段长度为 1261bp。
[0035] 通过常规PCR扩增鲤春病毒血症病毒SVCV-265株N基因片段，连接T载体后，构 建含有目的片段的质粒，命名为PMD/SVCV-N。用分光光度计测定质粒浓度为173. 4ng/y 1， PMD18-T载体长度为2692bp，插入片段长度为1261bp，每对碱基的平均分子量为660g/mol， 根据阿伏加德罗常量，计算出标准品的浓度为4X 101°拷贝/y1。将标准品进行10倍依次 稀释，分别得到浓度4X 109、4X 10S、4X 107、4X 106、4X 105、4X 104、4X 103、4X 102、4X IO1 拷贝/y I的标准品。选取4X IO7到40范围标准品为模板，进行实时荧光定量PCR反应， 每个浓度做三个平行样，通过定量PCR仪器自动绘制出荧光定量标准曲线。
[0036] 7500Fast荧光定量PCR仪会在反应过程中自动收集荧光，反应结束后，利用仪 器自带软件进行数据分析，扩增曲线图谱结果见图6。反应体系中标准品浓度依次为 4X107-40个拷贝，结果表明，7个数量级的范围内扩增曲线都为平滑的"S"型，表明本实时 定量PCR检测范围广，检测下限为40个拷贝。仪器自动绘制荧光定量标准曲线见图7,其中 模板浓度与Ct值的线性关系为：y=-3. 397x+44. 2,相关系数R2=O.999,呈现良好的线性关 系。
[0037] 结果表明，人工感染鲤鱼样品的各组织都含有鲤春病毒血症病毒，其中采用本发 明的N基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测各组织样品相对于采用G基因TaqMan荧光 探针所需循环数更少，基因拷贝数更高(见表1)。表明本发明的特异性引物和探针比目前广 泛使用的鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T1152-2011中的针对G基因的荧光探针和引物 更加灵敏。
[0038] 表1鲤鱼各组织鲤春病毒血症病毒荧光定量PCR检测结果
实施例4、 分析鲤春病毒血症病毒SYBRGREENI实时荧光PCR检测方法的特异性。
[0039] 采用本发明的特异性引物，利用SYBRGREENI实时荧光PCR检测方法检测鲤 春病毒血症病毒和其他水生病毒：传染性脾肾坏死病毒（ISKNV)，锦鲤疱疹病毒（KHV)，草 鱼呼肠孤病毒（GCRV)，对虾白斑综合征病毒（WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒 (IHHNV)0
[0040] 检测过程同实施例2,只是将待测样品的CDNA换成传染性脾肾坏死病毒（ISKNV)， 锦鲤疱疹病毒（KHV)，草鱼呼肠孤病毒（GCRV)，对虾白斑综合征病毒（WSSV)和传染性皮下 及造血器官坏死病毒（IHHNV)的cDNA或DNA。
[0041]SYBRGREENI实时荧光PCR的熔解曲线见图8,其中鲤春病毒血症病毒扩增产物 的Tm值为78. 64°C，其他5种病毒的Tm值均不在78. 5-79. 4°C的Tm值范围，且熔解曲 线的荧光信号值远低于阳性对照，因此表明采用本发明的特异性引物，利用SYBRGREENI 实时荧光PCR检测鲤春病毒血症病毒不会与其他水生病毒发生交叉反应。
[0042] 结果判定依据为：若采用SYBRGREENI荧光染料，当待测样品的荧光信号大于阈 值且Ct值彡37. 0,并有"S"型扩增曲线，同时Tm值介于78. 5°C-79. 4°C之间时，判定待 测样品中含有鲤春病毒血症病毒。
【主权项】
1. 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于以针对病毒N 基因设计的特异性N-TFl和N-TRl作为正向引物和反向引物，以N-tagl作为荧光 探针进行实时荧光定量PCR检测，其中，N-TFl: ATCAGGCCGATTATCCTTCCA ;N-TR1: AGATAAGCATTCACATGCTGTAT ；N-tagl-.5'-FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGAC ATATTGCCT-TAMRA-3'。2. 根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征 在于采用TaqMan荧光探针法定量PCR反应体系由以下组分组成：10 ??L 2 X SYBR Premix Ex Taq，10 ymol/L 正向引物、反向引物各 0.4 ??L;0.4 yl ROX reference dye II， 100ng/??L待测样品的cDNA 1-2 ??L，补充双蒸水至20 ??L。3. 根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在 于采用SYBR GREEN I荧光染料法定量PCR反应体系由以下组分组成：10 ??L 2 X Probe qPCR Premix Ex Taq，10 ymol/L 正向引物、反向引物各 0.4 ??L，0.8 ??L 10 ymol/L 荧 光探针，0.4 yl ROX reference dye II，100ng/??L 待测样品的cDNA 1-2 ??L，补充双蒸 水至20 ??L。4. 根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在 于TaqMan荧光定量PCR反应程序为：94° C 30 s ;之后94。C 3 s、60° C 30 s进行40 到45个循环；SYBR GREEN I荧光染料法PCR反应程序为：95° C 30 s ;之后95° C 5 s、 60° C 30 s、72° C 30 s进行40到45个循环，结束后，仪器会进行熔解曲线分析并计算待 测样品Tm值。5. 根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在 于结果判定依据为：若采用SYBR GREEN I荧光染料，当待测样品的荧光信号大于阈值且Ct 值彡37. 0,并有"S"型扩增曲线，同时Tm值介于78. 5° C-79. 4° C之间时，判定待测样品 中含有鲤春病毒血症病毒；若采用荧光探针，若待测样品荧光信号超过阈值且Ct < 37.0， 同时扩增曲线为平滑的"S"型，则可以判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒。
【专利摘要】一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，属于水生病毒检测技术领域。本发明提供了检测鲤春病毒血症病毒的特异引物探针组，由针对鲤春病毒血症病毒的特异引物对以及荧光探针组成。采用本发明提供的引物对鉴定鲤春病毒血症病毒具有良好的灵敏性和特异性。本发明能检测鲤春病毒血症病毒感染的病鱼组织，也能检测无症状的鲤春病毒血症病毒携带鱼和鲤春病毒血症病毒感染的细胞，在对进出境水生动物进行快速检测和疫病监控中具有极大的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105002298
【申请号】CN201510264774
【发明人】邵玲, 肖雨
【申请人】上海市水产研究所
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年5月21日