物系统公司（AppliedBiosystems)，福斯特城，加利福尼亚州， 美国）进行PCR，每次使用200ng总细胞DNA作为模板、300nM引物、和200nM探针。循环是 50°C下2分钟，95°C下10分钟，40个95°C下15秒和60°C下1分钟的循环。
[0084]F、免疫印迹
[0085] 根据标准方法进行免疫印迹。简言之，使用了NuPAGE凝胶系统（生命技术公司 (LifeTechnologies))、4%-12%bis-tris凝胶。在 20V、30 分钟后转移到PVDF膜。该单 元化lock)是T-PBS中的10 %N抑M(过夜）。初级MAb是小鼠抗-人IDUA1:300 (1. 5小 时）；在T-PBS中的1 %N抑M。次级：HRP连接的兔抗-小鼠1:3000 (1小时）；在T-PBS中 的 1%N抑M。用SuperSi即alWestDurachemiluminiscent底物（赛默科技公司（Thermo Scientific))进行检测，暴露在X射线胶片上30秒。
[0086] 实例3-小鼠和狗中的体内试验
[0087] 可W在狗中发现IDUA缺陷，允许了在大型动物中对疾病和疗法的研究。MPS I狗在IDUA基因中携带隐性（无效）突变，其中内含子1的供体剪切位点中的G〉A突 变在外显子-内含子连接处创造了过早的终止密码子[梅农（Menon) -K.P.，P.T.田 灯ieu)，和E.F.诺伊费尔德（Neufeld)，犬科粘多糖胆积症I下的犬科IDUA基因和突 变架构（Architectureofthec曰nineIDUAgene曰ndmut曰tionunderlyingc曰nine mucopolysaccharidosisI)，基因组学（Genomics)，1992. 14 (3) :p. 763-8.]。狗中的疾病进 程类似于贺勒-施艾氏综合征；疾病表现包括显著的骨骼疾病，包括胸廓变形。
[0088] 尿GAG分析是用于确定在临床环境中对MPSI的治疗的疗效的生化标记。
[0089] 通过石蜡切片的阿辛蓝（pH1)染色剂在主要器官中评价了糖胺聚糖（GAG)的累 积。细胞内未处理的GAG的累积在经甲苯胺蓝染色的来自嵌入塑料的组织的1ym薄切片 上尤其是良好可视化的。嵌入环氧树脂的组织的薄切片（lym)经甲苯胺蓝染色。运展示 了包含储存材料的细胞（"泡沫状的海绵细胞"）。
[0090] 用脑中的针对神经节巧脂GM3的抗体进行免疫组织化学。示出了神经元中异常的 GM3储存。在狗中评价了皮质并且在小鼠中评价了皮质和下丘脑。用免疫巧光评价了肝脏 中人IDUA的表达。
[0091] A、小鼠研究
[0092] 如在实例1中所述制备AAV8.TBG.修饰的hIDUA。对小鼠（约3个月大）进行静 脉内注射，剂量为约lxl〇iiGC、3xl〇i°GC、3x109GC、1x109GC并且在注射后约2周进行评 价。
[0093] 结果显示了在Wlxl〇ii、3x1〇1°、和3x109给药的动物中，GAG染色减少或完全不 存在。在运些动物中，在薄切片中观察到储存损伤的减少或完全不存在。
[0094] 在Wlx1〇9给药的动物中，GAG储存看起来或多或少如在未被治疗的小鼠中那样， 并且储存损伤看起来或多或少如在未被治疗的小鼠中那样。
[009引对于GM3储存，只对WlxIQiiGC和3xl0i°GC给药的动物进行了评价，并且观察到 了神经元中GM3储存的非常微弱的改善。
[009引在WlxIQiiGC给药的动物中观察到了IDUA的强表达（100%肝细胞）。运随着剂 量降低而下降，在lx109gC的情况下仅有非常少的阳性肝细胞。
[0097] B、犬科研究
[009引如在实例1中所述制备AAV8.TBG.修饰的hIDUA。对狗（约8个月大）进行静脉 内注射，剂量为约lxIQiiGC并且在注射后4个月后（即，1岁）进行评价。
[0099] 此项研究示出了储存损伤的逆转。更具体地，用阿辛蓝染色剂看到了所有主要器 官中GAG储存的几乎完全清除。在屯、脏、肾脏或肝脏薄切片中没有观察到储存损伤。在神 经元中观察到了GM3累积的减少或完全清除。在>95%的肝细胞中通过免疫巧光观察到了 IDUA在肝脏中的表达。
[0100] 实例4-用AAV2/8.TBG.hIDUA对贺勒-施艾氏进行治疗
[0101] 将在贺勒-施艾氏患者中对AAV8介导的IDUA基因转移进行评价。受试者将接 受单次载体输注到外周静脉中，运基于临床前数据（会导致酶的稳定产生，其水平接近 在正常受试者中获得的酶的水平）。试验可能设及不同载体剂量，例如，3xl〇iiGC/kg;lx l〇i2GC/kg;3xl〇i2GC/kg并且请添加剂量范围。对疗效的最佳非侵入性的评估是尿GAG水 平，尿GAG水平在疾病状态下提高并且在邸T后被部分矫正。将通过测量血清IDUA确定转 基因植入及其表达水平。还将在基因治疗前后测量尿GAG。
[0102] (序列表非关键词文字）
[0103] 针对包含在数字标识符<223〉下的非关键词文字的序列提供了W下信息。
[0104]
[0105]
[0106] W电子形式在此提交了标记为"Z6622PCT_ST25.txt"的序列表；运个序列表通过 引用结合在此。所有在本申请中引用的公开文件、专利、W及专利申请（包括提交于2013 年3月15日的优先权申请美国专利申请号61/788, 724)都通过引用W其全文结合在此，如 同各个单独的公开文件或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用而结合。虽然上述 发明已经通过说明W及实例的方式出于清楚理解的目标相当详细地进行了描述，但是本领 域技术人员就本发明的传授内容而言很容易清楚可W对其进行某些变化和修改而不偏离 所附权利要求的精神或范围。
【主权项】
1. 一种携带表达盒的重组载体，该表达盒包括人a-L-艾杜糖苷酸酶（hIDUA)基因，该 基因具有SEQIDNO: 1核苷酸序列或编码功能性人a-L-艾杜糖苷酸酶的、与SEQIDNO: 1 具有至少约80%-致性的序列，其中所述表达盒进一步包括指导人a-L-艾杜糖苷酸酶表 达的调控序列，所述调控序列包括肝脏特异性启动子。2. 根据权利要求1所述的重组载体，其中经修饰的hIDUA基因与SEQIDNO: 1具有至 少约85%到约90%的一致性。3. 根据权利要求2所述的重组载体，其中经修饰的hIDUA基因与SEQIDNO: 1具有至 少约95%到约99%的一致性。4. 根据权利要求1所述的重组载体，其中该功能性人a-L-艾杜糖苷酸酶选自下组，该 组由以下各项组成： (a) SEQIDNO: 2的约氨基酸1到约653 ; (b) 合成的人酶，包括与SEQIDNO: 2的约酸27到约653融合的异源前导序列；以及 (C)SEQIDN0:2的氨基酸序列的变体，该变体具有一种或多种修饰，该一种或多种修 饰包括：在氨基酸位置82处的H到Q的还原（SEQIDNO: 8);在位置105处的从R到Q的改 变（SEQIDNO:9);在位置116处的从G到R的改变（SEQIDNO: 10);在位置279处的从V 到A的改变（SEQIDN0:11);在位置346处的从L到R的改变（SEQIDN0:12);在位置361 处的从A到T的改变（SEQIDNO: 13);在位置449处的从H到N的改变（SEQIDNO: 14); 在位置454处的从V到I的改变（SEQIDNO: 15);在位置591处的从A到T的改变（SEQ IDNO: 16);和在位置622处的从A到T的改变（SEQIDNO: 17)。5. 根据权利要求1所述的重组载体，其中该启动子是TBG启动子。6. 根据权利要求1所述的重组载体，其中该载体进一步包括一个或多个增强子。7. 根据权利要求6所述的重组载体，其中这些增强子是相同或不同的。8. 根据权利要求6所述的重组载体，其中这些增强子选自下组，该组由以下各项组成： 内含子、CMV增强子、和amic/bik增强子。9. 根据权利要求6所述的重组载体，其中所选择的增强子的多于一个拷贝存在于该载 体中。10. 根据权利要求9所述的重组载体，其中该增强子的该多于一个拷贝串联定位。11. 根据权利要求1所述的重组载体，其中该表达盒进一步包括选自兔球蛋白polyA 的polyA。12. 根据权利要求1所述的重组载体，其质粒是pENN.TBG.hIDUA.nRBG。13. -种重组腺相关病毒（rAAV)颗粒，该颗粒具有AAV衣壳并且具有包装在其中的 5'反向末端重复序列（ITR)、在控制其表达的调节序列的控制下的人a-L-艾杜糖苷酸酶 (hIDUA)基因、和AAV3'ITR，其中所述hIDUA基因具有在SEQIDN0:1(图1)中示出的序 列或编码功能性人a-L-艾杜糖苷酸酶的、与SEQIDNO: 1示出的序列具有至少约95% - 致性的序列。14. 根据权利要求13所述的rAAV，其中经修饰的hIDUA基因在肝脏特异性启动子的控 制下进行表达。15. 根据权利要求14所述的rAAV，其中该启动子是TBG启动子。16. 根据权利要求13所述的rAAV，其中该载体进一步包括一个或多个增强子。17. 根据权利要求16所述的rAAV，其中这些增强子是相同或不同的。18. 根据权利要求16所述的rAAV，其中这些增强子选自下组，该组由以下各项组成：内 含子、CMV增强子、和amic/bik增强子。19. 根据权利要求18所述的rAAV，其中所选择的增强子的多于一个拷贝存在于该载体 中。20. 根据权利要求19所述的rAAV，其中该增强子的该多于一个拷贝串联定位。21. 根据权利要求13所述的rAAV，其中该rAAV颗粒包括AAV衣壳，该AAV衣壳选自 AAV8 和AAV9〇22. 根据权利要求21所述的rAAV，其中该rAAV是假型的。23. 根据权利要求22所述的rAAV，其中这些ITR来自AAV2。24. -种重组腺相关病毒颗粒AAV2/8.TBG.hIDUA.co。25. -种对于治疗I型粘多糖贮积症（MPSI)有用的组合物，该组合物包括根据权利要 求13到24中任一项所述的rAAV和药学上可接受的载体。26. -种用于治疗I型粘多糖贮积症的方法，该方法包括递送有效量的组合物，该组合 物包括药学上可接受的载体和根据权利要求13到24中任一项所述的rAAV。27. 根据权利要求25所述的方法，其中所述rAAV是静脉内递送的。28. 根据权利要求1所述的方法，其中将rAAV的约3x10 9到约3x10 12基因组拷贝递 送给受试者。29. 包括根据权利要求13到24中任一项所述的rAAV和药学上可接受的载体的组合物 用于治疗I型粘多糖贮积症（MPSI)的用途。
【专利摘要】提供了一种载体，该载体具有表达盒，该表达盒含有hIDUA基因，该基因具有SEQ？ID？NO:1序列或编码功能性人α-L-艾杜糖苷酸酶的、与SEQ？ID？NO:1序列具有至少约95％一致性的序列。该载体可以是生产载体或rAAV8。还提供了包含这些载体的组合物和治疗MPSI以及与贺勒氏(Hurler)、贺勒-施艾氏(Hurler-Scheie)和施艾氏(Scheie)综合征相关的症状的方法。
【IPC分类】C12N7/00, C12N7/01, C12N15/00
【公开号】CN105026554
【申请号】CN201480010987
【发明人】J·M·威尔森, B·L·哥达
【申请人】宾夕法尼亚大学托管会
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2901328A1, WO2014151341A1...