在一个实施例中，递送是通过静脉内递送。然而，仍然 可W选择其他给药途径。可替代地或另外地，希望的话，可W组合给药途径。
[0061] 在一个实施例中，本发明包括冻干组合物，该冻干组合物包含如在此所述的rAAV、 或冻干形式的rAAV混合物。任选地，一种或多种稳定剂或防腐剂存在于此组合物中。合适 地，为了使用，将冻干组合物与合适的稀释剂（例如，无菌盐水或缓冲盐水）进行重组。
[0062] 病毒载体的剂量将主要取决于如正被治疗的病症、患者年龄、体重和健康等因素， 并且因此在患者之间可W不同。例如，病毒载体的治疗有效剂量一般在从约0.ImL到约 100血、或约0. 1血到约10血、或约0. 1血到约5血、或约0. 5血到约1血溶液的范围，该溶 液包含浓度从约3x109到3x10"的基因组病毒载体（颗粒）/血的水悬浮剂。另一示例 性剂量是每1kg约3x109到3x10"AAV基因组。一种合适的体积是约1血。在另一个实施 例中，rAAV构建体的治疗有效剂量在约0.OOlng到约1000mg/70kg动物的范围中，其可W 用单个剂量或一系列的两个或更多剂量来递送。可W确定其他合适的剂量。可W调整剂量 来平衡治疗益处和任何副作用，并且运样的剂量可W取决于采用重组载体进行的治疗应用 而不同。
[006引治疗方法
[0064] 本发明的组合物避免了酶替代疗法的并发症，运些并发症与对重组酶的免疫应答 相关，其范围可W从溫和到全面过敏反应W及终生外周通路并发症如局部和全身感染。进 一步地，与ERT相比，本发明的组合物不需要长期、重复每周注射。不希望被理论所限制，在 此所述的肝脏定向治疗方法被认为对于通过提供高效、长期的由具有高转导效率的载体所 提供的基因转移而矫正与MPSI障碍相关的中枢神经系统表型是有用的，可W提供连续、升 高的循环IDUA水平，运提供了穿过血脑屏障的治疗手段。另外，AAV肝脏基因转移可W提 供积极耐受性并阻止酶抗体生成。
[0065] 提供了用于治疗I型粘多糖胆积症的方法，该方法包括递送治疗有效量的在此所 述的经修饰的hIDUA表达盒。还提供了用于治疗和/或改善贺勒氏、贺勒-施艾氏和施艾 氏综合征的症状的方法。
[0066] 在一个实施例中，rAAV是经静脉内递送的。
[0067] 在另一个实施例中，将约3x109到约3x1〇12的量的rAAV递送给受试者。尽管预 期单次给药rAAV是有效的，由于肝脏是再生器官，可W重复（例如，每季度、每两年、每年 度）或如另外方式所需给药。任选地，考虑到受试者的年龄和容忍输注的能力，可W经分离 的输注区段递送治疗有效量的初始剂量。然而，不需要全治疗剂量的重复每周注射，运为患 者提供在舒适度和治疗结果两方面的优势。
[0068] W下实例仅是说明性的并且不是对在此所述的发明的限制。
[0069] 实例1-转基因和载体生产
[0070] 合成了编码功能性人a寸-艾杜糖巧酸酶的经修饰的核巧酸序列。所得序列尤 其特别适合于人表达并且与功能性人IDUA基因化IDUA;基因库（Genbank)NP000194. 2)具 有小于约90%的一致性。然后将所得转基因插入到质粒中，质粒包含使用工程化Mlul和 Sail位点包装到可从宾夕法尼亚大学载体核屯、（UPennVectorCore)获得的AAV载体中所 必需的顺式元件。基因表达由人甲状腺素结合球蛋白（TBG)所驱动[林YOlayashiY)，莫 里'Y(MoriY)，詹森'OECJanssen0巧等人，人甲状腺素结合球蛋白基因：全序列和转录调 节（Humanthyroxine-bindingglobulingene:completesequenceandtranscriptional regulation),分子内分泌学（MolEndocrinol), 1993;7:1049 - 1060]。所得质粒（如图 2 中所示）祀順.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB包含受包括肝脏特异性TBG启动子的表达控制序列 控制的经修饰的hIDUA基因。质粒还包含AAV25' 口R、amic/bic增强子的串联重复序列、 TBG启动子、普洛麦格内含子序列、经修饰的人IDUA基因SEQIDN0:1、兔球蛋白polyA、和 AAV2-3'ITRo
[0071] 进行了大规模载体制备，基本上如由洛克化ock)等人所描述[重组腺相关病毒 载体的规模化快速、简单、和通用制造（Rapid,simple,andversatilemanufac1:u;ringof recombinantadeno-associatedviralvectorsatscale)，人类基因治疗化umGene Ther)，21 (10) : 1259-1271. (2010)]。在包含肥K293细胞的75%的融合单层的10层细胞堆 中进行了基于PEI的转染。对来自细胞堆的1化原种培养基进行澄清并然后由切向流过滤 进行浓缩。经舰克沙醇的ptipr巧；西格玛化学公司（Sigma化emicalCo.)，圣路易斯，密 苏里州）梯度对经浓缩后的澄清原种进行纯化。收集并合并在可见污染蛋白带正下方的所 有部分。对合并的部分在PBS/35mM的化C1中进行渗滤并使用离屯、超滤（AmiconUltra)15 自旋浓缩器（密理博公司（Millipore))进行浓缩。将甘油添加到渗滤后的浓缩产品达到 最终5%并且对制剂进行等分并储存在-8(rC下。所得载体在此被称为AAV8.TBG.hIDUA或 AAV2/8.TBG.hIDUA。在某些位置，重组AAV颗粒被称作AAV8.TBG.hIDUAco或AAV2/8.TBG. hIDUAco。质粒还包含AAV25' 口R、amic/bic增强子的串联重复序列、TBG启动子、普洛麦 格内含子序列、经修饰的人IDUA基因SEQIDN0:1、兔球蛋白polyA、和AAV2-3'口R。
[0072] 实例 2-
[007引 A、基于细胞的测定
[0074] 将肥K293细胞维持在生长培养基中，该生长培养基包含具有5 %胎牛血清（FBS; XX讶、1 %青霉素/链霉素（p/s;生命技术公司化ifeTechnologies?))的杜氏改良培 养基值MEM;規b㈱狡，生命技术公司（LifeTechnologies?))。根据制造商的推荐使用LipofectamineTM2000 (英杰公司（Invitrogen?)，生命技术公司（XifeTechnologies?)) 进行质粒DM转染。简言之，将细胞W5x10、细胞/孔的密度铺板于转染培养基 值MEMW%FBS，无p/s)中的6孔组织培养皿中并且允许其在5%C02中在37。下粘 附过夜。第二天，检查细胞90%-95%融合并且更新培养基。将质粒DNA和脂质体转 染化ipofectamine?)2000用Opti-MEMI饭减血清培养基（无血清）稀释到最终比率 1:2. 5 值NA:LipofectamineTM2000)。在与DNA溶液进行混合前，将LipofectamineTM2000 转染溶液在22°C下解育五分钟。在添加到包含细胞和培养基的孔之前，将运个包含DM: LipofectamineTM2000溶液的最终转染混合物进一步解育20分钟（22°C)。模拟细胞不接 受质粒DNA并且编码eGFP的质粒被用作转染对照。针对每个测试的构建体，对S个孔进 行转染。在5%C〇2中在37°下解育细胞；在四个小时后用生长培养基替换培养基。每个 孔的内容物在72个小时后收获并且在4°C下W4000rpm收集15分钟。将细胞重新悬浮在 100y1/孔的裂解缓冲液（0. 2%TritonX-100,0. 9%化C1，抑4. 0)中并且用满旋冷冻/ 解冻S次。此外，在最终冷冻/解冻前，用Benzonase在37°C下对裂解物处理30分钟。W 1000化pm(4°C)沉淀细胞碎片10分钟并且将最终澄清的细胞裂解物放到冰上并立即测定 酶活性。
[0075] B、组织裂解和蛋白提取
[0076] 在一层干冰上在盒子中对冷冻的组织进行半解冻并且将小片湿组织切（约20mg、 约lOmg脾脏）到小培养皿中。然后将预处理过的组织浸没在2-ml具有1ml裂解缓冲液 (0. 2%TritonX-100,0. 9% 化C1，抑 4. 0)和 5mm钢珠的埃彭道夫离屯、管（eppendo;rph) 中。在组织裂解器上W30化对样本进行匀浆2分钟。揽匀的样本WeOOOrpm简单旋转30 秒并且移除了 5mm钢珠。使用1-1/16"直径微号角用声处理对组织裂解物进行进一步破坏 并且将其在-80°C下冷冻过夜。第二天在22°C下对处理过的样本进行解冻并且通过离屯、 (10000巧m/10分钟/4°C)对其进行澄清。在测定前将来自脑部、或其他脂肪组织的漂浮脂 质层吸出。然后将样本储存在湿冰上并立即测定酶活性。
[0077]C、蛋白估算
[007引遵循制造商规程，使用基于考马斯（Coomassie)的布拉福德度ra壯ord)测定法 (赛默科技公司（ThermoScientific))来估算总蛋白。简言之，使用牛血清白蛋白度SA) 设置标准曲线来生成从1到25yg/ml的工作范围和无BSA的蛋白稀释缓冲液导致的空白。 从1/300到1/1200来两倍稀释样本并且W1:1比率的稀释蛋白：布拉福德试剂在96孔平 皿中进行混合。允许样本在22°C下平衡15分钟并且在读板机上W建议的595nm波长对吸 光度值进行收集。使用标准曲线和空白校正将原始值转换成yg/ml浓度。然后对微克数 量进行转换并且W毫克进行报告。
[007引 D、酶活性测定
[0080] 根据先前公开的方法[卡其斯化akkis)等人，分子遗传学与新陈代谢（Mol. Genet.Met油.），2001年3月；72 (3) : 199-20引将4-甲基伞形酬基aA-化喃艾杜糖醒酸、 环己基锭盐（4-MU-Ido;多伦多研究化学品公司（TorontoResearchQiemicals,Inc.))用 作底物对IDUA酶活性进行测定。简言之，用重蒸馈水（dd&O)和lOOy1lOOyM4-MU-Ido 底物使5-15y1裂解物、或血清达到100ii1，用反应缓冲液化IM乙酸钢抑3. 5,0. 15M 化C1，0. 05%TritonX-100)进行稀释，在丙締酸甲醋比色皿（赛默科技公司灯hermo Scientific))中组合。在37°C水浴中将反应解育1-3小时并且W添加lx终止缓冲液 (290mM甘氨酸，180mM碳酸钢，pH10. 5)结束。通过UV通道巧X365nm，血440-470nm)在 如antiFluor?-ST(普洛麦格（Promega))上读出结果。原始巧光值被记录并且使用4-甲 基伞形酬（M-5410;生物合成（Biosynth? ))的已知量的标准曲线将其转换成nmol/ml/ 虹。将细胞和组织裂解物归一化成估算的蛋白值（nmol/mg/虹；见题为"蛋白估算"的方法 章节）。
[0081]E、DNA提取和基因组拷贝分析
[0082] 使用化qmanPCR来确定二倍体细胞中的载体DNA负载。对于实时PCR进行的载 体基因组的检测和量化，使用QIAampDNA迷你试剂盒（QIAampDNAMiniKit)(凯杰公司 (Qiagen)，瓦伦西亚，加利福尼亚州，美国）从组织中提取总细胞DM。引物和探针组被设计 成用于祀向载体的nRBGpolyA区域，使用如下序列证向：GCCAAAAATTATGGGGACAT，反向：
[0083]ATTCCAACACACTATTGCAATG，探针：6FAM-ATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCT-TAMRA。用 Cis质粒建立用于载体基因组量化的标准曲线，cis质粒用于相应载体的生产。用化qMan 通用PCR预混合物（应用生