DNA 合成促进高效牵专导（Self-complement曰ry recombin曰nt曰deno-曰ssoci曰ted virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently ofDNAsynthesis)"，基因治 疗（Gene llierapy)，（2001年8月），第8卷，第16期，第1248-1254页。在例如美国专利 号6, 596, 535、7, 125, 717、和7, 456, 683中描述了自我互补AAV，其中每篇都通过引用W其 全文结合在此。运些和其他合适的生产方法在本领域技术人员的知识内并且不是对本发明 的限制。
[0041] 可W使用已知的技术来生成在此所述的重组腺相关病毒（AAV)。运种方法设及培 养包含编码AAV衣壳的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；在最低限度上由AAV反向 末端重复序列（ITR)和转基因构成的表达盒；和足够的辅助功能W允许将该表达盒包装到 AAV衣壳蛋白中。
[0042] 需要在宿主细胞中培养W在AAV衣壳中包装AAV表达盒的组件可W在相反侧提供 给宿主细胞。可替代地，所需要的组件（例如，表达盒、r巧序列、cap序列、和/或辅助功 能）中的任何一种或多种可W由稳定的宿主细胞提供，该稳定的宿主细胞已使用本领域技 术人员已知的方法而被工程化来包含所需要的组件中的一种或多种。最合适地，运样的稳 定的宿主细胞将包含受诱导型启动子控制的所需要的一种或多种组件。然而，所需要的一 种或多种组件可W受组成型启动子的控制。在此提供了合适的诱导型和组成型启动子的实 例，在适合与转基因一起使用的调节元件的讨论中。在仍另一个替代方案中，所选择的稳定 的宿主细胞可W包含受组成型启动子控制的所选择的一种或多种组件和受一种或多种诱 导型启动子控制的其他所选择的一种或多种组件。例如，可W生成源自293细胞的稳定的 宿主细胞（其包含受组成型启动子控制的E1辅助功能），但该宿主细胞包含受诱导型启动 子控制的rep和/或cap蛋白。仍然地，可W由本领域技术人员生成其他稳定的宿主细胞。
[0043] 可W将生产本发明的rAAV所需的表达盒、rep序列、cap序列、和辅助功能W转 移携带在其上的序列的任何遗传因子的形式递送到包装宿主细胞。可W用任何合适的方 法（包括在此所述的那些）来递送所选择的遗传因子。用于构建本发明的任何实施例的 方法对核酸操作技术人员是已知的并且包括基因工程、重组工程、和合成技术。例如，见萨 姆布鲁克（Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册（Mole州larCloning:AL油oratory Manual)，冷泉港出版社（冷泉港（ColdSpringHarbor)，纽约）。类似地，生成rAAV病毒 体的方法是众所周知的并且对合适的方法的选择不是对本发明的限制。例如，见K?菲舍 化.Fisher)等人（1993)，病毒学杂志（J.Virol.) ,70:520-532 和美国专利号 5, 478, 745。
[0044] 除非另外说明，在此所述的AAVITR、和其他所选择的AAV组件可W容易地选自于 任何AAV。可W使用本领域技术人员可获得的技术来容易地将运些ITR和其他AAV组件从 AAV序列分离。运样的AAV可W从学术、商业、或公共来源（例如，美国种质保存中屯、，马纳 萨斯，弗尼吉亚州）分离或获得。可替代地，参照公开序列（如在文献中或数据库（例如， 基因库（GenBank?)、PubMed吸等）中可获得的）通过合成或其他合适的手段可W获 得AAV序列。
[004引A、表达盒
[0046] 该表达盒如在此所定义。另外，如在此所述的表达盒和/或载体可W包含另外的 转基因调节序列。该表达盒包装到衣壳蛋白中并且递送到所选择的宿主细胞。
[0047] 1.转基因
[0048] 本发明可W包括多个转基因的使用。本领域技术人员可W容易地选择合适的转基 因。对转基因的选择不认为是对本发明的限制。
[004引 2.调节元件
[0050] 除了W上针对表达盒所标识的主要元件，载体还包括常规控制元件，运些控制元 件W如下方式可操作地连接到转基因：该方式允许其在受到质粒载体转染或受到本发明所 生产的病毒的感染的细胞中转录、翻译和/或表达。如在此所使用，"可操作地连接的"序列 包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列，和在相反侧或在远处起作用W控制感兴趣的基 因的表达控制序列两者。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列； 有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺巧酸化（polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强 翻译效率的序列（即，Kozak共有序列）；增强蛋白稳定性的序列；W及当需要时，增强所编 码产物的分泌的序列。大量表达控制序列（包括天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性 启动子）是本领域已知的并且可W被利用。
[0051] 组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virusHRSV) LTR启动子（任选地具有RSV增强子）、巨细胞病毒（CMV)启动子（任选地具 有CMV增强子）[例如，见博沙特度oshart)等人（1985)，细胞（Cell) ,41:521-530]、SV40 启动子、二氨叶酸还原酶启动子、P-肌动蛋白启动子、憐酸甘油激酶（PGK)启动子、和EF1 启动子[英杰公司（Invitrogen)]。诱导型启动子允许对基因表达的调节并且可W受到外 源提供的化合物、环境因素（如溫度）、或存在特异性生理状态（例如，急性期、细胞的特定 分化状态、或仅在复制细胞时）的调节。诱导型启动子和诱导型系统可W从多种商业来源 中获得，包括但不限于英杰公司（Invitrogen)、克罗泰克公司（Clontech)和阿瑞雅德公司 (Ariad)。许多其他系统已被描述并且可W由本领域技术人员容易地选择。受到外源提供 的化合物调节的诱导型启动子的实例包括锋诱导型绵羊金属硫蛋白（MT)启动子、地塞米 松值ex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[国际专利公开 号W0 98/1008引；昆虫蚁皮激素启动子[诺（No)等人（1996)美国国家科学院院刊（Proc. 化tl. Acad. Sci. USA) ,93:3346-3351]，四环素阻抑系统[哥森（Gossen)等人（1992)美国 国家科学院院刊（Proc.化tl. Acad. Sci. USA) ,89:5547-5551]、四环素诱导型系统[哥森 (Gossen)等人（1995)科学（Science)，268:1766-1769,还见哈维化arvey)等人（1998)化 学生物学目前观点（Curr.0pin.Chem. Biol.) ,2:512-51引、RU486诱导型系统[王（Wang) 等人（1997)自然生物技术（化t.Biotech) ,15:239-243和王（Wang)等人（1997)基因治疗 (Gene Ther.) ,4:432-441] W及雷帕霉素诱导型系统[马加里（Magari)等人（1997)，临床 研究杂志（J. Clin. Invest) ,100:2865-2872]，包括例如从阿瑞雅德公司（Ariad)可获得的 阿金特（Argent?)系统。在本文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是受具体生理状态 (例如，溫度、急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时）调节的那些。
[0052] 转基因的另一个实施例包括可操作地连接到组织特异性启动子上的基因。例如， 如果希望在骨骼肌中表达，应当使用在肌肉中有活性的启动子。运些包括来自编码骨骼 0-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌间线蛋白、MHC、肌肉肌酸激酶的启动子、 W及具有比天然存在的启动子更高活性的合成肌肉启动子（见李化i)等人，（1999)自然 生物技术（化t.Biotech. )，17:241-245)。除其他之外，组织特异性启动子的实例针对CNS/ 神经元是众所周知，包括例如，神经元特异性締醇化酶（NS巧启动子（安德森（Andersen) 等人，（1993)，细胞和分子神经生物学（Cell.Mol.化urobiol. )，13:503-15)，神经微丝轻 链基因（皮克利（PiccioU)等人，（1991)，美国国家科学院院刊（Proc.化tl.Acad.Sci. USA) ,88:5611-5)，和神经元特异性V奸基因（皮克利（Piccioli)等人，（1995)，神经元 (Neuron) ,15:373-84)。在另一个实施例中，将使用针对转基因的天然启动子。当希望转基 因的表达模仿天然表达的时候，可W优选天然启动子。当必须时序性或发育性地、或W组织 特异性方式、或响应于特异性转录刺激调节转基因的表达时，可w使用天然启动子。在进一 步实施例中，还可W使用其他天然表达控制元件（如增强子元件、聚腺巧酸化位点或Kozak 共有序列）来模仿天然表达。
[005引为便于参考，转基因、启动子/增强子、化及5'和3'AAVITR的组合在此被称为表 达盒。具有本发明的教导，可W依靠常规技术对运样的表达盒进行设计。
[0054] 3.将表达盒递送到AAV包装宿主细胞
[00巧]可W在任何合适的载体上携带该表达盒，例如质粒，其被递送到宿主细胞。可W对在本发明中有用的质粒进行工程化，运样使得它们适合于复制并且任选地整合在原核细 胞、哺乳动物细胞、或两者中。运些质粒（或携带表达盒的其他载体）包含允许表达盒在真 核生物和/或原核生物中复制的序列和用于运些系统的选择标记。除其他之外，选择性标 记或报告基因可W包括编码卡那霉素、遗传霉素、潮霉素或嚷岭霉素抗性的序列。质粒还可 W包括某些选择性报告基因或标记基因，运些选择性报告基因或标记基因可W用于发出载 体存在于细菌细胞中的信号，如氨节青霉素抗性。质粒的其他组件可W包括复制起点和扩 增子，如采用爱-己核抗原病毒核抗原的扩增子系统。运个扩增子系统、或其他类似的扩增 子组件允许细胞中的高拷贝附加型复制。优选地，携带表达盒的分子转染到细胞中，在该细 胞中它可W短暂地存在。可替代地，可W稳定地将表达盒或染色体地或作为附加体整合到 宿主细胞的基因组中。在某些实施例中，表达盒可W存在于多个拷贝中，任选地为头接头、 头接尾、或尾接尾多联体。合适的转染技术是已知的并且可W被容易地利用来将表达盒递 送到宿主细胞。
[0056] -般地，当通过转染递送包括表达盒的载体时，将处于从约5yg到约100yg DM、约10yg到约50ygDM的量的载体递送至约lxlO4个细胞到约lx10 "个细胞、或 约lx1〇5个细胞。然而，将运样的因子如所选择的载体、递送方法和所选择的宿主细胞考 虑在内，可W调整载体DNA相对于宿主细胞的量。
[0057] B、包装宿主细胞
[005引除了表达盒，宿主细胞包含驱动本发明的AAV衣壳蛋白在宿主细胞中表达的序列 和与在表达盒中发现的AAVITR的来源具有相同来源、或交叉补充来源的rep序列。为了 包装本发明的rAAV，包装宿主细胞还需要辅助功能。运样的辅助功能在本领域是众所周知 的并且将不在此进行重复。类似地，用于生产具有AAV衣壳的合适的载体的方法是已知的。 [例如，见美国公开专利申请号US2007/0036760]。
[0059] 编码在此所述的表达盒的rAAV的构建体同样可W悬浮在生理相容性载体中，可 W给药到受试者。在一个实施例中，载体是单独的无菌盐水或任选地还有多种缓冲溶液中 的任一种（例如，憐酸盐缓冲盐水）。其他示例性载体包括乳糖、薦糖、憐酸巧、明胶、右旋糖 酢、琼脂、果胶、芝麻油、和水。对载体的选择不是对本发明的限制。
[0060] 任选地，本发明的组合物除了rAAV和一种或多种载体之外，还可W包含其他常规 药物成分如防腐剂、或化学稳定剂。