些ITR中之一或二者可W被截短。例如，可W将包含D序列缺失和末端 解离位点（trs)缺失的截短的5'ITR用于例如自我互补AAV。在一个实施例中，rAAV是假 型的，即AAV衣壳来自与提供口R的AAV不同来源的AAV。在一个实施例中，使用了AAV血 清型2的ITR。然而，可W选择来自其他合适的来源的ITR。
[0027] 如在此所述，将携带功能性人a 艾杜糖巧酸酶化IDUA)基因的在指导功能性 人a 艾杜糖巧酸酶的酶在细胞中表达的调节序列的控制下的表达盒递送给患有在此 所述的病症中的一种的患者。
[0028] 该表达盒包含hIDUA基因，其特征在于具有SEQIDNO: 1核巧酸序列。运个序列由 发明人所开发，具有与基因库（Genbank)中编码SEQIDN0:2的公开基因序列NP000194. 2 约83 %的一致性。在另一个实施例中，该表达盒包含hIDUA基因（其特征在于具有与SEQ IDNO: 1具有至少约80%-致性的核巧酸序列）并且编码功能性人a 艾杜糖巧酸酶。 在另一个实施例中，该序列与SEQIDNO: 1具有至少约85%-致性或与SEQIDNO: 1具有 至少约90%-致性并且编码功能性人aA-艾杜糖巧酸酶。在一个实施例中，该序列与 沈QIDNO: 1具有至少约95%-致性、与沈QIDNO: 1具有至少约97%-致性、或与沈QID N0:1具有至少约99%-致性并且编码功能性人aA-艾杜糖巧酸酶。在一个实施例中，运 涵盖了全长hIDUA基因，包括人aA-艾杜糖巧酸酶的前导肤序列（即，编码SEQIDN0:2 的约氨基酸26、或约氨基酸27到约氨基酸653)，对应于SEQIDNO: 1的约1到约78。在另 一个实施例中，hIDUA基因编码合成的功能性人a 艾杜糖巧酸酶的酶，该酶是包括与功 能性a 艾杜糖巧酸酶的酶的分泌部分融合的异源前导序列的合成肤，即，SEQIDN0:2 或在此指定的其功能性变体之一的约氨基酸27到约653。
[0029] 相对于序列的一致性或相似性在此处被定义为：在比对序列并且引入空位（如果 需要的话）W实现最大序列一致性百分比之后，在候选序列中与在此所提供的肤和多肤区 域相同（即，相同残基）或相似（即，基于共有侧链特性来自相同组的氨基酸残基，见下文） 的氨基酸残基的百分比。百分比（％) -致性是两个多核巧酸或两个多肤之间的关系的度 量，如通过分别比较其核巧酸或氨基酸序列所确定。通常，对有待比较的两条序列进行比 对来给出序列之间的最大相关性。对两条序列的比对进行检查，并且确定给出两条序列之 间的准确氨基酸或核巧酸对应关系的位置的数量，除W比对的总长度并乘W100来给出百 分比一致性数字。运个百分比一致性数字可W根据有待比较的序列的全长来确定，运种方 式对于高度同源的长度相同或非常相似的序列是特别合适的，或者根据较短定义长度来确 定，运种方式对于长度不相等或具有较低同源水平的序列更合适。存在多种算法和基于其 的计算机程序，运些在文献中是可用的和/或可公开或商业可得的W用于进行比对和百分 比一致性。算法或程序的选择不是对本发明的限制。
[0030] 合适的比对程序的实例包括例如在化ix下并然后导入到Bioedit程序的软件 化USTALW(霍尔?T.A. (Hall,T.A.) 1999,BioEdit:用于Windows95/98/NT的用户友好 的生物序列比对编辑器和分析程序度i〇Edit:auser-friendlybiologicalsequence alignmenteditorandanalysisprogramforWindows95/98/NT)，核酸专题论文集 系列（Nucl.Acids.Symp.Ser.) ,41:95-98);威斯康辛序列分析包（WisconsinSequence AnalysisPackage),版本 9. 1(德弗罗.J.(DevereuxJ.)等人，核酸研究（NucleicAcids Res.) ,12:387-395,1984,可从美国威斯康辛州麦迪逊的遗传学计算机集团（Genetics ComputerGroup)获得）。程序邸STFIT和GAP可W用于确定两个多核巧酸之间的百分比 一致性和两条多肤序列之间的百分比一致性。
[0031] 其他用于确定序列之间的一致性和/或相似性的程序包括例如，可从美国马 里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中屯、（NCB，化tional Center化r Biotechnology Information, Bethesda, Md. , USA)获得并可通过NCBI的主页（WWW.ncbi. nlm. nih. gov)访 问的BLAST程序家族，GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序（版本2. 0)。使用ALIGN 程序W比较氨基酸序列时，能使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12并且缺口罚分为 4 ;W及FASTA(皮尔森?W. R.任earson W. R.)和李普曼?D.J.化ipmanD.J.)，美国国家科 学院院刊（Proc.化tl. Acad. Sci. USA) ,85:2444-2448,1988,可获得为威斯康辛序列分析包 的一部分）。SeqWeb软件（对于GCG威斯康辛包的基于网页的界面：Gap程序）。
[0032] 如贯穿本说明书及权利要求书所使用的，术语"包括"（compriSing)和"包 含"（including)是把其他组件、元件、整体、步骤等包括在内的。相反地，术语"组成"及其 变体是将其他组件、元件、整体、步骤等排除在外的。除非另外规定，否则术语"约"涵盖了 在±10%内并包括其的变化。
[0033] 在一个实施例中，该表达盒针对人肝脏定向表达而设计。因此，肝脏特异性启动 子尤其特别适合于该表达盒。在一个实施例中，选择了甲状腺素结合球蛋白启动子。在一 个实施例中，TBG启动子具有图1的核巧酸442到901的序列。可替代地，可W选择另一 种肝脏特异性启动子。除其他之外，组织特异性启动子的实例针对肝脏和其他组织是众 所周知的（白蛋白，宫武（Miyatake)等人，（1997)，病毒学杂志（J.Virol.) ,71:5124-32; 乙型肝炎病毒核屯、启动子，桑迪格（Sandig)等人，（1996)，基因治疗（Gene化er.)， 3:1002-9;甲胎蛋白（AFP)，阿己斯诺特（Arbuthnot)等人，（1996)，人类基因治疗（Hum. Genellier.) ,7:1503-14)，骨巧素（斯泰因（Stein)等人，（1997)，分子生物学导报（Mol. Biol.Rep. )，24:185-96);谷唾液酸蛋白（陈（化en)等人，（1996)，骨矿物质研究杂志 (J.BoneMiner.Res.) ,11:654-64)，淋己球（CD2,汉萨尔（Hansal)等人，（1998)，免疫学杂 志（J.Immunol. )，161:1063-8 ;免疫球蛋白重链；T细胞受体链），神经元（如神经元特异性 締醇化酶（NSE))启动子（安德森（Andersen)等人，（1993)，细胞和分子神经生物学（Cell. Mol.Neurobiol.) ,13:503-15)，神经微丝轻链基因（皮克利（Piccioli)等人，（1991)，美国 国家科学院院刊（Proc.化tl.Acad.Sci.USA) ,88:5611-5)，和神经元特异性V奸基因（皮克 利（Piccioli)等人，（1995)，神经元（Neuron) ,15:373-84)。可W选择其他启动子（非肝脏 特异性的），但是包含其的表达盒可能不具有带有TBG或另一种肝脏特异性启动子的那些 表达盒的全部优点。可替代地，可W选择可调节的启动子。例如，参见W0 2011/126808B2， 通过引用结合在此。
[0034] 在一个实施例中，该表达盒包括一个或多个表达增强子。在一个实施例中，该表达 盒包含两个或更多个表达增强子。运些增强子可W是相同的或可W各不相同。例如，增强 子可W包括amic/b化增强子。运个增强子可W存在于互相邻近定位的两个拷贝中。可替 代地，增强子的双拷贝可W由一个或多个序列分开。仍在另一个实施例中，该表达盒进一步 包含内含子，例如普洛麦格（Promega)内含子。其他合适的内含子包括本领域已知的那些， 例如，如在wo2011/126808中所述。
[0035] 进一步地，本发明的表达盒具有合适的聚腺巧酸化信号。在一个实施例中，polyA 序列是兔球蛋白polyA。在一个实施例中，polyA序列特征在于具有图1的nt3261-3387。 可替代地，另一种polyA(例如人生长激素化GH)聚腺巧酸化序列）是SV40polyA，或合成 polyA。仍然地，其他常规调节元件可W另外地或任选地包括在表达盒中。
[0036] 在一个实施例中，将表达盒工程化到合适的载体上，例如，使用本领域技术人员已 知的技术的质粒载体。任选地，本发明的组合物可W包含包括经修饰的人IDUA基因的第一 表达盒和包括不同基因的第二表达盒。在仍另一个实施例中，可W从多于一个表达盒来表 达功能性人IDUA，该多于一个表达盒可W位于多个载体上，例如，如在W0 2011/126808中 所述。
[0037] 在一个实施例中，该表达盒由祀順.TBG.hIDUA.nRBG携带，该质粒用于生成携带 该表达盒的重组腺相关病毒。
[00測 生产AAV病毒颗粒
[0039] 在一个实施例中，本发明提供了重组腺相关病毒（rAAV)颗粒，该颗粒具有AAV衣 壳并且具有包装在其中的5'反向末端重复序列（口时、在控制其表达的调节序列的控制下 的人〇寸-艾杜糖巧酸酶化IDUA)基因、和AAV3'口R，其中所述hIDUA基因具有在SEQID NO: 1 (图1)中示出的序列或编码功能性人aA-艾杜糖巧酸酶的、与SEQIDNO: 1示出的 序列具有至少约95%-致性的序列。一种特别期望的rAAV是AAV2/8.TBG.hIDUA.CO。
[0040] 制备基于AAV的载体的方法是已知的。例如，见美国公开专利申请号 2007/0036760 (2007年2月15日），将其通过引用结合在此。使用AAV8的AAV衣壳尤其 特别适合于在此所述的组合物和方法。在美国专利7, 282, 199B2、US7, 790, 449、和US 8, 318, 480中描述了AAV8序列和基于AAV8衣壳生成载体的方法，将运些文件通过引用结 合在此。还特别适合于在本法命中使用的是AAV9衣壳。在美国专利7,906，111中描述了 AAV9序列和基于AAV9衣壳生成载体的方法，将该文件通过引用结合在此。然而，还可W 选择或生成其他AAV衣壳来在本发明中使用。在上文引用的美国专利7, 282, 199B2、US 7, 790, 449、US8, 318, 480、和美国专利7, 906, 111中提供了许多运样的AAV的序列，和/或 运些序列可W从基因库（GenBank)获得。可W合成地或使用多种分子生物学和基因工程技 术来容易地生成运些AAV衣壳中的任何的序列。合适的生产技术对于本领域技术人员是熟 知的。例如，见萨姆布鲁克（Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning:A L油oratory Manual),冷泉港出版社（冷泉港（Cold Spring Harbor),纽约）。可替代地， 寡核巧酸编码肤（例如，CDR)或运些肤自身可W例如由众所周知的固相肤合成法而合成生 成（梅里菲尔德（Merrifield)，（1962)，美国化学会志（J.Am. Chem.Soc.),85:2149;斯图尔 特（Stewart)和杨（Young)，固相肤合成（弗里曼（Rreeman)，旧金山，1969)PP.27-62)。还 见DM?麦卡迪值M McCarty)等人，"自我互补重组腺相关病毒（scAAV)载体独立于