一种促进肉类熟化的复合蛋白酶的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种促进肉类熟化的复合蛋白酶的制备及应用，属于提取生物活性产品技术领域。
【背景技术】
[0002]随着生活水平的提高，现在肉类对于人类来说是日常餐桌常见的食品，目前，人们在食用肉类时候主要采用蒸煮和熏烤两种方式。
[0003]蒸煮肉类时，为了使肉质更加熟烂、味道更加美味，人们常使用高压锅蒸煮，但是往往不仅使得蒸煮时间过长，而且还达不到理想的熟烂效果。在食用后很容易被微生物侵蚀不能够长期保存，一般情况下3天左右就会变质腐烂，无法食用，即使放冰箱，也只可以保存5天左右，造成浪费。
[0004]烟熏肉制品由于其独特的烟熏风味，深受国内外消费者的青睐。食品烟熏技术是最古老的食品制作技术之一，这一技术不仅多数适用于鱼和肉类。将食品置于火上、封闭的烟熏炉或室内，控制性燃烧燃材产生的烟气和高温对食品进行熏制，经过烟熏的食品除了具有良好的耐贮藏性，还具有色香味，但是传统工艺烟熏的肉制品往往熏烤时间过长，短时间加热会发生仅仅食品表面熟、里面生的状况，另外传统熏制品含有多种多环芳烃和亚硝酸盐，他们主要来于熏材燃烧产物中PAHS的直接污染，或者熏制过程中肉类脂肪焦化与蛋白质高温分解，多环芳烃和亚硝酸盐化合物多具有致癌性，特别是亚硝酸盐是强致癌物质，可诱导人或动物发生突变、畸变或癌变，因此有效去除熏烤过程中产生的有害物质是非常重要的事情。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前人们在食用肉类时候主要采用蒸煮和熏烤两种方式，肉类在蒸煮后会散发出诱人的香味，但是很容易被微生物侵蚀不能够长期保存，一般情况下3天左右就会变质腐烂，无法食用，如果进行熏烤，不仅熏烤时间过长，而且肉类只是表面熟，里面生，最主要是熏烤过程中会产生亚硝酸盐类致癌物质，对人体危害非常大，提供了一种促进肉类熟化的复合蛋白酶的制备及应用，该方法以洗净的罗非鱼内脏为原料，通过组织粉碎和离心处理，并伴以超声辅助提取得到蛋白酶粗提液，再在磁力搅拌的同时加入茶多酚进行络合反应，以及加入磷酸盐缓冲液继续高速离心处理得到复合蛋白酶原液。在肉类熏烤前洒上复合蛋白酶，不仅没有任何危害人体健康的致癌物质产生，而且缩短了肉的熏烤时间，促进了肉的熟化，达到了腐而不烂，熟而不化的效果。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
一种促进肉类熟化的复合蛋白酶的制备，其特征在于具体制备步骤为:
(I)称取清洗干净的罗非鱼内脏400?500g，按照固液比1:4分别加入蒸馏水、石油醚、丙酮和工业己烷摇床振荡I?2h，再用组织捣碎机在4?6°C下捣碎30?40s，之后静置 10 ?20min ； (2)将捣碎后的罗非鱼内脏放入高速冷冻离心机于4?6°C、5000?7000r/min条件下离心10?20min，之后收集沉淀物，自然晾干后备用；
(3)按固液比为1:5向上述沉淀物中加入pH为6?8的磷酸钾缓冲液，用组织捣碎机匀浆30?40s，在20?30°C下浸渍70?90min，之后将其移入超声波提取器于超声频率为15?20kHz，功率为50W的条件下，辅助提取4?6min ；
(4)将辅助提取液移入高速离心机，在4?6°C的条件下离心处理15?20min，离心转速为6000?8000r/min，提取上清液，得到蛋白酶粗提液；
(5)取400?500mL粗酶液放置于磁力搅拌机上边搅拌边加入180?200g/L的茶多酚溶液，直至茶多酚终质量浓度为8g/L，之后继续搅拌30?40min，使其完全络合；
(6)将上述络合物在3?4°C条件下放置5?7h，再在4?6°C下用离心机离心20?30min，离心转速9000?10000r/min，滤去上清液，将沉淀物用1/2原粗酶液体积的磷酸钾缓冲液溶解，4?6°C下静置24?36h，再高速离心30?40min，离心转速5000?7000r/min，取其上清液，利用液氮在一 40?一 30°C下进行瞬时灭菌，灭菌时间10?15s，即得一种促进肉类熟化的复合蛋白酶原液。
[0007]—种促进肉类熟化的复合蛋白酶的应用，其特征在于具体应用方法是:
(1)取500?100g小米洗净，自然晾干备用；
(2)向自然晾干的小米中加入20?30g淀粉酶和300?500mL水酶解15?20min，使小米呈半水解状态；..(3)取燃烧后的秸杆灰用去离子水浸泡6?12h后过滤得到碱性液体，将新鲜荷叶用此碱性液体浸泡12?24h后自然晾干备用；
(4)取2?4kg新鲜牛肉，向其表面均勾喷洒本发明制得的复合蛋白酶原液，酶解3?5min后再往牛肉表面撒少量食用盐，将碱液浸泡过的荷叶铺在炭火上，荷叶上铺一层半水解状态的小米，之后将处理后的肉类置于小米上，用荷叶覆盖，文火熏烤7?Sh即可。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)荷叶包裹，使得熏烤的过程中没有致癌物质产生，对人体没有危害；
(2)延长了肉类的保质期，使其不容易变质腐烂，口感细腻，健康卫生；
(3)熏烤前洒上复合蛋白酶，不仅缩短了肉的熏烤时间，而且促进了肉的熟化，达到了腐而不烂，熟而不化的效果。
【具体实施方式】
[0009]首先称取清洗干净的罗非鱼内脏400?500g，按照固液比1:4分别加入蒸馏水、石油醚、丙酮和工业己烷摇床振荡I?2h，再用组织捣碎机在4?6°C下捣碎30?40s，之后静置10?20min ;然后将捣碎后的罗非鱼内脏放入高速冷冻离心机于4?6°C、5000?7000r/min条件下离心10?20min，之后收集沉淀物，自然晾干后备用；接下来按固液比为I: 5向上述沉淀物中加入pH为6?8的磷酸钾缓冲液，用组织捣碎机匀浆30?40s，在20?30°C下浸渍70?90min，之后将其移入超声波提取器于超声频率为15?20kHz，功率为50W的条件下，辅助提取4?6min ;随后将辅助提取液移入高速离心机，在4?6°C的条件下离心处理15?20min，离心转速为6000?8000r/min，提取上清液，得到蛋白酶粗提液；之后取400?500mL粗酶液放置于磁力搅拌机上边搅拌边加入180?200g/L的茶多酚溶液，直至茶多酚终质量浓度为8g/L，之后继续搅拌30?40min，使其完全络合；最后将上述络合物在3?4°C条件下放置5?7h，再在4?6°C下用离心机离心20?30min，离心转速9000?10000r/min,滤去上清液，将沉淀物用1/2原粗酶液体积的磷酸钾缓冲液溶解，4?6°C下静置24?36h，再高速离心30?40min，离心转速5000?7000r/min，取其上清液，利用液氮在一 40?一 30°C下进行瞬时灭菌，灭菌时间10?15s，即得一种促进肉类熟化的复合蛋白酶原液。其具体应用方法是首先取500?100g小米洗净，自然晾干备用；然后向自然晾干的小米中加入20?30g淀粉酶和300?500mL水酶解15?20min，使小米呈半水解状态；接下来取燃烧后的秸杆灰用去离子水浸泡6?12h后过滤得到碱性液体，将新鲜荷叶用此碱性液体浸泡12?24h后自然瞭干备用；最后取2?4kg新鲜牛肉，向其表面均勾喷洒本发明制得的复合蛋白酶原液，酶解3?5min后再往牛肉表面撒少量食用盐，将碱液浸泡过的荷叶铺在炭火上，荷叶上铺一层半水解状态的小米，之后将处理后的肉类置于小米上，用荷叶覆盖，文火熏烤7?8h即可。
[0010]首先称取清洗干净的罗非鱼内脏400g，按照固液比1:4分别加入蒸馏水、石油醚、丙酮和工业己烷摇床振荡lh，再用组织捣碎机在4°C下捣碎30s，之后静置1min ;然后将捣碎后的罗非鱼内脏放入高速冷冻离心机于4°C、5000r/min条件下离心lOmin，之后收集沉淀物，自然晾干后备用；接下来按固液比为1:5向上述沉淀物中加入pH为6的磷酸钾缓冲液，用组织捣碎机匀浆30s，在20°C下浸渍70min，之后将其移入超声波提取器于超声频率为15kHz，功率为50W的条件下，辅助提取4min ;随后将辅助提取液移入高速离心机，在4°C的条件下离心处理15min，离心转速为6000r/min，提取上清液，得到蛋白酶粗提液；之后取400mL粗酶液放置于磁力搅拌机上边搅拌边加入180g/L的茶多酚溶液，直至茶多酚终质量浓度为8g/L，之后继续搅拌30min，使其完全络合；最后将上述络合物在3°C条件下放置5h，再在4°C下用离心机离心20min，离心转速9000r/min，滤去上清液，将沉淀物用1/2原粗酶液体积的磷酸钾缓冲液溶解，4°C下静置24h，再高速离