一种从钝顶螺旋藻制备高纯度叶绿素a的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然色素技术领域，尤其涉及一种高纯度叶绿素a的制备方法。
【背景技术】
[0002]叶绿素是高等植物、藻类和光合细菌进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于叶绿体中的类囊体膜上。叶绿素具有促进造血、补充维生素、强化解毒、提高抗病等多种用途。例如:饮用叶绿素对产妇或因意外而失血的人都很有益处。
[0003]叶绿素的主要类型有:镁卟啉化合物(包括叶绿素a、b、c等)、原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不是很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都可以导致其分解。在酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁离子成为脱镁叶绿素。因此，商品化的叶绿素a纯度一般都低于95%。
[0004]微藻具有单位面积产量高，生长不需要肥沃的土地，可以利用滩涂、盐碱地、荒漠等不适宜耕种的土地进行规模化养殖等优势。与从高等植物叶片中提取色素相比，从微藻中提取叶绿素的原料来源更广泛，不需要叶片粉碎，便于自动化操作。
[0005]钝顶螺旋藻是蓝藻的一种，本发明以钝顶螺旋藻为原料，本发明制备的叶绿素a不含叶绿素b，HPLC纯度大于99.5%。
【发明内容】
[0006]本发明针对商品化叶绿素a纯度较低的问题，提出了一种高纯度叶绿素a的制备方法。
[0007]本发明采取的技术方案是:
[0008]本发明高纯度叶绿素a制备方法的具体步骤如下:
[0009]⑴以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体；
[0010]⑵藻体用乙醇萃取若干次，萃取液合并；
[0011]⑶萃取液中加入适量石油醚(60?90°C )，加水至分相，含色素的石油醚相用水洗涤两次；
[0012](4) 100?200目中性氧化铝柱层析分离纯化叶绿素a。首先用含0.3%乙醇的石油醚溶液润洗中性氧化铝柱，然后上样，再用体积含量0.3%?10%的乙醇一石油醚混合溶剂梯度冲洗；
[0013](5)含叶绿素a的溶液经减压旋转蒸发回收溶剂，获得叶绿素a沉淀
[0014](6)用适量的乙醇溶解叶绿素a沉淀，加水制成悬浊液，-80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿素a粉末。
[0015]步骤⑶中用正己烷反萃取。
[0016]步骤⑶中所用的水为饱和食盐水。
[0017]步骤⑷中用含0.3%乙醇的正己烷溶液润湿氧化铝柱，上样后采用乙醇一正己烷混合溶剂梯度冲洗。
[0018]本发明制备的叶绿素a纯度高，HPLC纯度大于99.5%。
【附图说明】
[0019]图1为实施例4所得产品乙醇溶液的吸收光谱图。
[0020]图2为实施例4所得产品乙醇溶液的荧光发射光谱图。
[0021]图3为实施例4所得产品的高效液相色谱(HPLC)分析图。
[0022]图4为实施例4所得产品的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD1-T0F)质谱图。基质中的三氟乙酸使叶绿素a脱镁转化为脱镁叶绿素a，带正电的脱镁叶绿素a的分子离子峰([M+H]+)，质荷比m/z为872.050，与脱镁叶绿素a的理论分子量871.20 —致。注:叶绿素a的理论分子量893.49。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例是对本发明的进一步描述。
[0024]实施例1
[0025]本发明的高纯度叶绿素a的制备方法的具体步骤如下:
[0026]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0027]萃取液中加入适量石油醚(60?90°C )，加水至分相，含色素的石油醚相用水洗涤两次。
[0028]在层析柱中填充100-200目中性氧化铝，先用含0.3%乙醇的石油醚溶液润湿氧化铝柱，然后上样，再采用0.3 %、10 %的乙醇一石油醚混合溶剂梯度冲洗。先冲出的是橙黄色的类胡萝卜素，后冲出的是蓝绿色的叶绿素。旋蒸回收溶剂，获得墨绿色的叶绿素a沉淀。
[0029]实施例2
[0030]本发明的高纯度叶绿素a的制备方法的具体步骤如下:
[0031]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0032]萃取液中加入适量石油醚(60?90°C )，加饱和食盐水至分相，含色素的石油醚相用饱和食盐水洗涤两次。
[0033]在层析柱中填充100-200目中性氧化铝，先用含0.3%乙醇的石油醚溶液润湿氧化铝柱，然后上样，再采用0.3%、1%的乙醇一石油醚混合溶剂梯度冲洗。先冲出的是橙黄色的类胡萝卜素，后冲出的是蓝绿色的叶绿素。旋蒸回收溶剂，获得墨绿色的叶绿素a沉淀。
[0034]实施例3
[0035]本发明的高纯度叶绿素a的制备方法的具体步骤如下:
[0036]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0037]萃取液中加入适量正己烷，加水至分相，含色素的正己烷相用水洗涤两次。
[0038]在层析柱中填充100-200目中性氧化铝，先用含0.3%乙醇的正己烷溶液润湿氧化铝柱，然后上样，再采用0.3%、10%的乙醇一正己烷混合溶剂梯度冲洗。先冲出的是橙黄色的类胡萝卜素，后冲出的是蓝绿色的叶绿素。旋蒸回收溶剂，获得墨绿色的叶绿素a沉淀。
[0039]实施例4
[0040]本发明的高纯度叶绿素a的制备方法的具体步骤如下:
[0041]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0042]萃取液中加入适量正己烷，加饱和食盐水至分相，含色素的正己烷相用饱和食盐水洗涤两次。
[0043]在层析柱中填充100-200目中性氧化铝，先用含0.3%乙醇的正己烷溶液润湿氧化铝柱，然后上样，再采用0.3%、1%的乙醇一正己烷混合溶剂梯度冲洗。先冲出的是橙黄色的类胡萝卜素，后冲出的是蓝绿色的叶绿素。旋蒸回收溶剂，获得墨绿色的叶绿素a沉淀。
[0044]用适量的乙醇溶解叶绿素a沉淀，加水制成悬浊液，-80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿素a粉末。
[0045]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，应当理解的是，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据上述说明对这些实施例进行改进或变换，而这些改进或变换都应属于本发明所述权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种从钝顶螺旋藻制备高纯度叶绿素a的方法，其特征在于:所述方法的具体步骤如下: ⑴以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体； ⑵藻体用乙醇萃取若干次，萃取液合并； ⑶萃取液中加入适量正己烷或石油醚，加水至分相进行反萃取，含色素的溶液用水洗涤； (4)100?200目中性氧化铝柱层析分离纯化叶绿素a，首先用含0.3%乙醇的正己烷或石油醚溶液润洗氧化铝柱，上样后用乙醇一正己烷或乙醇一石油醚混合溶剂梯度冲洗； (5)含叶绿素a的溶液经减压旋转蒸发回收溶剂，获得叶绿素a沉淀。2.如权利要求1所述的高纯度叶绿素a的制备方法，其特征在于用适量的乙醇溶解(5)中的叶绿素a沉淀，加水制成悬浊液，_80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿素a粉末。3.如权利要求1所述的高纯度叶绿素a的制备方法，其特征在于(3)中所用的水为饱和食盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度叶绿素a的制备方法，所述方法的步骤如下：(1)以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体；(2)藻体用乙醇萃取三次，萃取液合并；(3)萃取液中加入适量正己烷或石油醚，加水至分相进行反萃取，含色素的溶液用水洗涤两次；(4)100～200目中性氧化铝柱层析分离纯化叶绿素a，首先用含0.3％乙醇的正己烷或石油醚溶液润洗氧化铝柱，上样后用乙醇－正己烷或乙醇－石油醚混合溶剂梯度冲洗；(5)含叶绿素a的溶液减压旋转蒸发回收溶剂，即可获得高纯度的叶绿素a。本发明制备的叶绿素a不含叶绿素b，HPLC纯度大于99.5％。
【IPC分类】C07D487/22
【公开号】CN105061437
【申请号】CN201510528132
【发明人】于道永, 李泉, 张宏玉, 李富强, 吴晨露, 葛保胜, 黄方
【申请人】中国石油大学(华东)
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月25日