使用免疫球蛋白片段的胰岛素缀合物的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 本申请是申请号为201180022035. X的中国专利申请的分案申请，原申请是2011 年04月04日提交的PCT国际申请PCT/KR2011/002331于2012年10月31日进入中国国 家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及具有改善的体内持续时间和稳定性的胰岛素缀合物、包含该胰岛素缀 合物的长效制剂及其制备方法，该胰岛素缀合物通过将胰岛素与免疫球蛋白Fc区经非肽 基聚合物共价连接而制备。本发明提供了用于在有胰岛素缺陷病症（如糖尿病）的对象中 进行治疗的方法。本发明的胰岛素缀合物将肽的体内活性维持在相对高的水平，并显著延 长了其血清半衰期，从而极大地提高了对胰岛素治疗的药物依从性。
【背景技术】
[0003] 胰岛素是由胰腺β细胞分泌的肽，它在控制机体的血糖水平中起着中心作用。当 机体中胰岛素分泌不正常或者所分泌的胰岛素不起作用时，血糖水平不被调节，从而发生 糖尿病。这种糖尿病被称为II型糖尿病。当胰腺不产生足够的胰岛素从而使得血糖水平 增加时导致I型糖尿病。
[0004] 通常用化学合成的经口降血糖剂治疗II型糖尿病，在一些情况下，用胰岛素治疗 患者。而I型糖尿病则需要胰岛素治疗。
[0005] 目前使用的胰岛素治疗方法是在饭前/饭后注射胰岛素。但是，这样的胰岛素注 射应当每天3次地连续施用，其导致患者疼痛或不适。为了克服这一问题已进行了许多尝 试。它们之一是通过提高肽类药物的膜透过性从而经口或鼻吸入地递送所述肽类药物的方 法。并不理想地，与注射剂相比，该方法示出非常低的递送效率，因此，维持所需水平的肽类 药物体内活性仍然有许多困难。
[0006] 同时，有一种在皮下注射大量药物后延迟药物吸收的方法，从而使得通过每日仅 注射一次来维持血液水平。一些所开发的药物（Ijantus 1% Sanofi-aventis)已得到 许可并且目前被用于患者。此外，已进行研究以延长作用时间，从而开发出地特胰岛素 (Levemir) (Novo Nordisk)，其通过用脂肪酸修饰胰岛素而制备，其中通过胰岛素分子在注 射部位的自缔合或者通过可逆结合血液中的白蛋白产生长效作用。但是，这些方法在注射 部位产生疼痛，并且每日注射也引起患者的极大不适。
[0007] 已进行了许多努力以提高肽类药物的血清稳定性以及在延长的时间中将血液中 的药物维持在高水平，从而使药物的药效最大化。肽类药物的这些长效制剂需要提高肽类 药物的稳定性并将效价维持在足够高的水平，而不会引起患者的免疫应答。就制备肽类药 物的长效制剂而言，按照常规使用具有高溶解度的聚合物（如聚乙二醇（PEG))来化学修饰 肽类药物的表面。
[0008] PEG非特异性地结合靶标肽的特定位点或多个位点以起到增加肽的分子量的作 用，从而抑制通过肾的损失，并防止水解，而不引起任何副作用。例如，W02006/076471描述 了 B型利钠肽（B-type natriuretic peptide，BNP)，其与NPR-A结合从而激活cGMP的产 生并引起动脉血压降低，因此，BNP被用作充血性心力衰竭治疗剂，它与PEG连接，从而保持 其生理活性。美国专利第6, 924, 264号描述了 PEG与艾塞那肽-4 (exendin-4)的赖氨酸残 基结合从而增加了其体内驻留时间。这种方法增加了 PEG的分子量，从而增加了肽类药物 的体内驻留时间。但是，随着分子量的增加，肽类药物的效价显著降低，并且肽的反应性也 降低了。因此，其不理想地降低了产率。
[0009] WO 02/46227描述了使用基因重组技术通过将GLP-I、艾塞那肽-4或其类似物与 人血清白蛋白或免疫球蛋白片段（Fe)偶联而制备的融合蛋白。美国专利第6, 756, 480号 描述了通过将甲状旁腺激素（PTH)和其类似物与Fc区偶联而制备的Fc融合蛋白。这些方 法可以解决如聚乙二醇化产量低和非特异性的问题，但是它们仍然具有这样一个问题：增 加血液半衰期的作用不像预期的那么显著，并且在一些情况下，效价也低。为了使增加血液 半衰期的作用最大化，使用了多种肽接头，但是可能引起免疫应答。此外，如果使用具有二 硫键的肽（如BNP)，那么错误折叠的可能性高，而如果使用具有非天然氨基酸残基的肽，那 么其可以通过基因重组产生，但难度很大。
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 鉴于此，进行了大量且深入的研究以开发能够使胰岛素的血清半衰期和体内活性 同时实现最大化的方法，结果发现免疫球蛋白Fc区、非肽基聚合物和胰岛素通过共价键彼 此位点选择性地相连接，从而与已知框内融合方法相比显著增加了血清半衰期，得到了本 发明。
[0012] 解决方案
[0013] 本发明的一个目的是提供极佳的胰岛素缀合物、包含该胰岛素缀合物的长效制剂 及其制备方法，该胰岛素缀合物维持胰岛素的体内活性并显著地延长其血清半衰期，。
[0014] 本发明的有利作用
[0015] 本发明的胰岛素缀合物将肽的体内活性维持在相对高的水平，并显著地延长了其 血清半衰期，从而极大地提高了有胰岛素治疗需要的患者的药物依从性。
【附图说明】
[0016] 图1是胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的药代动力学分析的结果。
[0017] 图2是对胰岛素衍生物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的体内效力进行比较的结果。
[0018] 图3是使用尺寸排阻柱分析胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的β链的苯丙氨 酸处（B1F)90%或更高聚乙二醇化所得的结果。
[0019] 图4a至4c是分析胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的β链特异性结合所得的 结果。
【具体实施方式】
[0020] -方面，为了达到上述目的，本发明提供了一种胰岛素缀合物，其通过将胰岛素与 免疫球蛋白Fc区经非肽基聚合物连接而制备，其中所述非肽基聚合物与胰岛素 β链的氨 基端相连接。
[0021] 在本发明中，胰岛素是由胰腺应答于血液中升高的葡萄糖水平而分泌的肽，以吸 收肝、肌肉或脂肪组织中的葡萄糖并将其转化为糖原，并阻止使用脂肪作为能量来源，从而 起控制血糖水平的作用。该肽包括其激动剂、前体、衍生物、片段和变体，优选天然的短效或 长效胰岛素。
[0022] 天然胰岛素是由胰腺分泌以促进葡萄糖吸收和抑制脂肪降解的激素，从而起 控制血糖水平的作用。胰岛素是从不具有调节血糖水平之功能的前体（称为胰岛素原 (proinsulin))通过加工形成的。胰岛素的氨基酸序列如下：
[0023] α 链
[0024] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-A sn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO. 1)
[0025] β 链
[0026] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-V al-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pr〇-Lys-Thr(SEQ ID NO. 2)
[0027] 胰岛素激动剂意指与胰岛素受体结合从而示出与胰岛素相当的生物活性的化合 物，其与胰岛素的结构无关。
[0028] 胰岛素衍生物意指与天然胰岛素具有至少80%的氨基酸序列同源性的肽，其可在 氨基酸残基的一些基团上进行了化学替换（例如，α-甲基化、α-羟基化）、缺失（例如， 脱氨）或修饰（例如，N-甲基化），并且具有调节机体中血糖水平的功能。
[0029] 胰岛素片段意指这样的片段，其在天然胰岛素的N端或C端添加或缺失一个或更 多个氨基酸，其中可以添加非天然氨基酸（例如，D型氨基酸），并且具有调节机体中血糖水 平的功能。
[0030] 胰岛素变体意指具有与天然胰岛素不同的一个或更多个氨基酸序列且具有调节 机体中血糖水平之功能的肽。
[0031] 胰岛素的激动剂、衍生物、片段和变体的每种制备方法可以单独使用或组合使用。 例如，本发明包括下述肽，即具有一个或更多个与天然肽不同的氨基酸并且N-端氨基酸残 基脱氨，而且具有调节机体中的血糖水平之功能的肽。
[0032] 在一个特定实施方案中，本发明中使用的胰岛素可以通过重组技术生成，还可使 用固相合成方法合成。
[0033] 此外，本发明中使用的胰岛素的特征在于非肽基聚合物与胰岛素 β链的氨基端 相连接。在本发明中，使用该非肽基聚合物作为接头。胰岛素 α链中的修饰引起活性和安 全性降低。因此，在本发明中，作为接头的非肽基聚合物与胰岛素的β链的氨基端相连接， 以保持胰岛素活性和提高安全性。
[0034] 本文所使用的术语"活性"意指胰岛素结合胰岛素受体的能力，并意指胰岛素通过 与胰岛素受体相结合发挥其作用。
[0035] 可以通过pH控制（优选地控制在4. 5至L 5的范围内）来完成非肽基聚合物与 胰岛素 β链氨基端的这一结合。
[0036] 本文所使用的术语"Ν-端"可以与"Ν-端区域"互换使用。
[0037] 在一个具体实施例中，本发明人通过将PEG与免疫球蛋白Fc区的N-端连接并将 其选择性地偶联到胰岛素 β链的N-端，从而制备了胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fe缀合物。 本发明中制备的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fe缀合物的血清半衰期显著地增加到约18小 时，并且其在疾病动物模型中示出降血糖作用。因此，可以制备出维持胰岛素体内活性的新 的长效胰岛素制剂。
[0038] 免疫球蛋白Fe区用作药物载体是安全的，因为它是体内代谢的可生物降解多肽， 此外，与整