白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导 脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。
【背景技术】
[0002] 健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件，结构与功能 健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源。多种致病因素，如：眼外伤、手术创 伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失， 从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜 修复的上皮细胞这一难题亟待解决。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为 角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求 的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次 移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且 给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健 眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的 自体和异体移植的细胞来源。
[0003] 脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且， 脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导 hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。
[0004] 三维培养技术通过模拟体内细胞生长微环境，建立细胞之间及胞外基质的广泛联 系，通过形成一定的三维立体结构，促进细胞近似于在机体内的基因表达、胞外基质分泌及 细胞生物学功能活性，故其在干细胞在再生医学及临床转化医学应用方面有着非常大的发 展前景。完整的三维细胞培养体系需要由三部分组成，支架、种子细胞、培养系统缺一不可。 近年来支架材料的研究表明，水凝胶材料成为最热门的研究方向。
[0005] 水凝胶是一类具有亲水性但不能在水中溶解而只能发生溶胀的材料，是自然界中 普遍存在的一类物质形态。水凝胶中的水可使溶于其中的低分子量物质从其中渗透扩散， 具有膜的特性，凝胶的这一扩散特性可实现氧、营养物质的传递和代谢废物的排出，为细胞 生存提供一个类似活体组织的环境。水凝胶按材料来源可分为天然材料制备的水凝胶和合 成材料水凝胶以及两者复合的水凝胶。天然水凝胶材料主要包括胶原、壳聚糖、藻酸盐、琼 脂糖、透明质酸等。其优点是细胞信号识别性好，可促进细胞的黏附、增殖和分化，有良好 的生物相容性及生物可降解性；缺点是来源有限，难于加工，难以保证不同批次材料的同一 性，存在免疫原性，降解速度、力学性能难以控制等问题。合成水凝胶是由亲水性的聚合物 经物理或化学交联形成的水溶胀体。聚异丙基丙烯酰胺，聚乙烯醇，聚乙二醇及其衍生物是 研究较多的合成材料。人工合成水凝胶材料不受来源的限制，容易加工成型，可根据需要调 整物理、化学、生物力学和降解性能。但是在实际运用中也发现了不少缺点：合成材料通常 存在细胞亲和力、亲水性以及细胞黏附性较差，缺乏细胞识别信号位点等缺陷。
[0006] 因此，应当研发一种具备细胞外基质功能，适合细胞生长发育的人工仿生微环境 的水凝胶，并将其用于细胞的培养和诱导分化。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供白芨多糖水凝胶、培养基质及其应 用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。本发明提供的白芨多糖水凝胶为 白芨多糖经硫酸化修饰后与e_聚赖氨酸交联获得，该凝胶能够在体外为细胞提供能贴近 体内的微环境。采用该凝胶作为支架诱导诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化能够 显著提高细胞的分化率。
[0008] 本发明提供的白芨多糖水凝胶的制备方法为：由白芨多糖经硫酸化后以e-聚赖 氨酸交联制得白芨多糖水凝胶。
[0009] 白芨（Bletillastriata)为兰科白芨属多年生草本植物，以干燥的块茎入药。白 芨多糖具有的良好吸湿性和亲水性，能促进氧气、营养物质和其它水溶性代谢产物的通透 作用，同时还能加强上皮和基质细胞的粘附性。本发明将白芨多糖经硫酸化后与携带多官 能团的e-聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。本发明提供的白芨多糖水凝胶与白芨多糖溶液 自身形成的水凝胶相比，具有更加良好的孔隙，和更高的粘度。并且，该制备方法操作简单， 成胶时间短。本发明提供的白芨多糖水凝胶能够在体外提供为细胞提供与体内相似的微环 境，从而更加有利于细胞的生长和分化。
[0010] 在本发明的实施例中，白发多糖的制备方法为：将白发粉碎后经水提醇沉，所得沉 淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D~50000D透析，干燥制得白芨多糖。
[0011] 在一些实施例中，水提醇沉具体为：将白芨粉以水浸提后，提取液与乙醇水溶液混 合，静置过夜制得沉淀。
[0012] 在一些实施例中，浸提的温度为80°C，浸提的时间为4h。
[0013] 在一些实施例中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为95 %。
[0014] 在一些实施例中，乙醇水溶液与提取液的体积比为1:3。
[0015] 经过氯仿和丁醇的混合液抽提后，提取物中的蛋白被去除。离心后取水相。
[0016] 在一些实施例中，氯仿和丁醇的混合物中，氯仿和丁醇的体积比为5:1。
[0017] 在一些实施例中，沉淀溶于水后溶液的体积是氯仿和丁醇混合物的3倍。
[0018] 在一些实施例中，透析采用的透析液为蒸馏水。
[0019] 在一些实施例中，干燥为冻干。
[0020] 本发明制得白芨多糖的分子量为30000D~50000D。
[0021] 在一些实施例中，干燥后的白芨多糖还经过纯化。
[0022] 在一些实施例中，纯化为将冻干后的白芨多糖溶解后，过交联葡聚糖G-100柱。
[0023] 在本发明的实施例中，硫酸化的方法为氯磺酸-吡啶法。
[0024] 在一些实施例中，硫酸化的试剂为氯磺酸与吡啶。
[0025] 在一些实施例中，氯磺酸与吡啶的体积比为1:6。
[0026] 在本发明的实施例中，白芨多糖的硫酸化具体为：将白芨多糖溶于无水N，N-二甲 基甲酰胺，室温搅拌30min后，加入硫酸化试剂（氯磺酸与吡啶的体积比为1:6)，置于60°C 水浴搅拌反应3h。
[0027] 在一些实施例中，经硫酸化后，调整pH值为7. 5,减压浓缩后以蒸馏水为透析液透 析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。
[0028] 在本发明的实施例中，e_聚赖氨酸溶液的分子量为600Da~4300Da，其中包括25 个~30个赖氨酸残基。
[0029] 在本发明的实施例中，交联具体为，将硫酸化的白芨多糖溶液与e_聚赖氨酸溶 液混合后静置。
[0030] 在一些实施例中，e -聚赖氨酸溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中e -聚赖氨酸的质 量分数为3%。
[0031] 在本发明的实施例中，硫酸化的白芨多糖溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中硫酸化 白芨多糖的浓度为200 y g/mL。
[0032] 在本发明的实施例中，交联的温度为18°C~35°C，时间为20s~40s。
[0033] 在一些实施例中，交联的时间为30s。
[0034] 本发明提供方法制备的白芨多糖水凝胶。
[0035] 本发明提供的白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的 生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC-MSCs与羊膜上皮 细胞共培养7天后，hUC-MSCs的分化率可达31. 96%。且细胞生长旺盛，呈球圆形。