到细胞悬液；
[0034] a2)、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养，获得CIK细胞。
[0035] 在本发明提供的上述具体的CIK细胞培养方法中，首先将外周血单个核细胞在所 述培养液中重悬。其中，所述外周血单个核细胞（PBMC)优选按照下述方法获取：
[0036] 外周血与生理盐水混合，得到的混合液加到聚蔗糖（Ficoll)中，然后对由外周 血、生理盐水和Ficoll组成的混合体系进行离心处理。其中，所述外周血与生理盐水的体 积比优选为1~2 :1~2。所述离心处理的转速优选为2000~3500rpm;所述离心处理的时 间优选为15~30min。离心处理结束后，提取离心管中的PBMC条带层，提取获得的提取物 用生理盐水重悬，重悬后进行离心处理，所述离心处理的转速优选为1500~2000rpm，所述 离心处理的时间优选为5~15min。离心处理结束后，提取离心管中的PBMC，提取获得的提 取物用生理盐水重悬，重悬后进行离心处理，所述离心处理的转速优选为1500~2000rpm， 所述离心处理的时间优选为5~15min，离心结束后，去除上清液，获得外周血单个核细胞。
[0037] 在本发明中，重悬所述外周血单个核细胞采用的培养液在上文中已做介绍，再次 就不再赘述。重悬后，得到细胞悬液的外周血单个核细胞密度优选为〇.5XIO6~IX10 6个 /mL〇
[0038] 获得细胞悬液后，将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养。其中，所述培 养的温度为37°C;所述培养的CO2体积浓度为5% ;所述培养的时间优选为12~16天，更 优选为14天。在本发明提供的一个实施例中，所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培 养的具体过程为：
[0039] 首先将所述细胞悬液接种到第一细胞培养容器中进行培养。所述第一细胞培养容 器优选为T75flask。待第一细胞培养容器中细胞密度优选介于IO6~3X10 6个/mL时，向 第一细胞培养容器中补加培养液，直至细胞悬液总体积为50~75mL。在本发明中，使所述 第一细胞培养容器中细胞密度介于IO6~3X106个/mL所耗费的培养时间一般为3~6天， 优选为5天。之后，将经过第一细胞培养容器中的细胞悬液转入第二细胞培养容器中进行 培养。所述第二细胞培养容器优选为T175flask或培养袋。在第二细胞培养容器中培养的 过程中，优选对培养液中细胞的密度进行控制，所述培养液中细胞的密度优选控制为1〇 6~ 3XIO6个/mL。在本发明中，优选采用向养容器中补加所述CIK细胞培养液的方式来控制培 养液中细胞的密度，补液前培养液中细胞的密度优选不大于3XIO6个/mL，补液后培养液中 细胞的密度优选为〇. 5XIO6~I. 5X10 6个/mL。在本发明提供的一个实施例中，控制培养 液中细胞的密度过程中补加的所述CIK细胞培养液中不含血清。所述经过第一细胞培养容 器培养后的细胞悬液在第二细胞培养容器中培养的时间优选为9~10天，更优选为9天。
[0040] 培养结束后，收集细胞培养容器中的细胞，收集的细胞即为本发明培养获得的CIK 细胞。
[0041] 本发明提供的CIK细胞培养方法在CIK细胞培养过程中添加了香菇多糖，香菇多 糖能够促进PBMC产生淋巴细胞活化因子和释放辅助性T细胞因子，从而促进CIK细胞的增 殖，进而使培养得到的CIK细胞表现出大的扩增倍数、强的杀伤活性和高的细胞表面抗原 含量。同时，本发明提供的培养方法通过优化CIK细胞培养过程中使用的培养液的配方，进 一步促进CIK细胞的增殖，增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。实验结果表明，采用本发明提供 的方法培养CIK细胞14天后，CIK细胞扩增倍数大于300倍，CIK细胞体外杀伤率（效靶比 40:1)大于（80 ± 2) %，CIK细胞表面抗原（⑶3+和⑶56+)数量大于48 %。
[0042] 本发明提供了一种香菇多糖在CIK细胞培养中的应用。本发明提供的应用在CIK 细胞培养过程中添加了香菇多糖，促进了 CIK细胞的增殖。
[0043] 为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
[0044] 实施例1
[0045] 1)抽取40ml外周血，把外周血转移至50ml离心管中，用1倍体积的生理盐水稀 释混勾，缓慢的加到Ficoll(挪威Axis-Shield公司，产品编号14547)中，3500rpm离心 30min；
[0046] 2)离心结束后，抽取离心管中的PBMC条带层，用生理盐水重悬，然后2000pm离心 15min；
[0047] 3)离心结束后，去除上清液，剩余物再次用生理盐水重悬，然后2000rpm离心 15min；
[0048] 4)离心结束后，去除上清液，得到约I.5XIO7个PBMC;
[0049] 5)使用培养液重悬上述获得的PBMC，得到细胞悬液；所述培养液由IFN-y(基因 公司市售产品）、CD3激发型单抗（基因公司市售产品）、香菇多糖（基因公司市售产品）、血 清和RPMI-1640培养基组成，其中，IFN-y含量为1000U/ml，⑶3激发型单抗含量为80ng/ 1111，11-2含量为6001]/1111，香菇多糖含量为0.31^/1111，血清含量为20%(体积百分数）；所 述细胞悬液中PBMC的密度为IXIO6个/ml;
[0050]6)将细胞悬液接种到T75fIask中，在37°C、5 % (体积浓度）CO2条件下进行培养；
[0051] 7)每天观察生长状况，第5天向T75flask中补加培养液，直至T75flask中细胞 悬液总体积为50~75mL;所述培养液由IFN-y、⑶3激发型单抗、香菇多糖和RPMI-1640 培养基组成，其中，IFN-y含量为1000U/ml，⑶3激发型单抗含量为80ng/ml，IL-2含量为 600U/ml，香菇多糖含量为0? 25mg/ml;
[0052] 8)将T75fIask中的细胞悬液转入T175fIask中，补加步骤7)使用的培养液；补 液后保证细胞密度在〇.5XIO6~I.5X106个/ml的范围内；
[0053] 9)每隔2天补加步骤7)使用的培养液，也可视细胞的生长情况确定培养液补加 的时间间隔，补液前保证细胞的密度不大于3XIO6Ail，补液后保证细胞密度为0. 5XIO6~ I. 5XIO6个/ml;
[0054] 10)培养到第14天对细胞进行收集。
[0055] 实施例2
[0056] 1)抽取40ml外周血，把外周血转移至50ml离心管中，用1倍体积的生理盐水稀 释混勾，缓慢的加到Ficoll(挪威Axis-Shield公司，产品编号14547)中，2800rpm离心 20min；
[0057] 2)离心结束后，抽取离心管中的PBMC条带层，用生理盐水重悬，然后1800pm离心 IOmin；
[0058] 3)离心结束后，去除上清液，剩余物再次用生理盐水重悬，然后1800rpm离心 IOmin；
[0059] 4)离心结束后，去除上清液，得到I.8XIO7个PBMC;
[0060]5)使用培养液重悬上述获得的PBMC，得到细胞悬液；所述培养液由IFN-y(基因 公司市售产品）、CD3激发型单抗（基因公司市售产品）、香菇多糖（基因公司市售产品）、 血清和RPMI-1640培养基组成，其中，IFN-y含量为500U/ml，⑶3激发型单抗含量为50ng/ 1111，11-2含量为5001]/1111，香菇多糖含量为0.251^/1111，血清含量为10%(体积百分数）；所 述细胞悬液中PBMC的密度为IXIO6个/ml;
[0061] 6)将细胞悬液接种到T75fIask中，在37°C、5% (体积浓度）CO2条件下进行培养；
[0062] 7)每天观察生长状况，第5天向T75fIask中补加培养液，直至T75fIask中细胞悬 液总体积为50~75mL;所述培养液由IFN- y、⑶3激发型单抗、香菇多糖和RPMI-1640培养 基组成，其中，IFN-y含量为500U/ml，CD3激发型单抗含量为50ng/ml，IL-2含量为500U/ml，香菇多糖含量为〇? 25mg/ml;
[0063] 8)将T75fIask中的细胞悬液转入T175fIask中，补加步骤7)使用的培养液；补 液后保证细胞密度在〇. 5XIO6~I. 5X10 6个/ml的范围内；
[0064] 9)每隔2天补加步骤7)使用的培养液，也可视细胞的生长情况确定培养液补加 的时间间隔，补液前保证细胞的密度不大于3XIO6Ail，补液后保证细胞密度为0. 5XIO6~ I. 5XIO6个/ml;
[0065] 10)培养到第14天对细胞进行收集。
[0066] 实施例3
[0067] 1)抽取40ml外周血，把外周血转移至50ml离心管中，用1倍体积的生理盐水稀 释混勾，缓慢的加到Ficoll(挪威Axis-Shield公司，产品编号14547)中，2000rpm离心 15min；
[0068] 2)离心结束后，抽取离心管中的PBMC条带层，用生理盐水重悬，然后1500pm离心 5min；
[0069] 3)离心结束后，去除上清液，剩余物再次用生理盐水重悬，然后1500rpm离心 5min；
[0070] 4)离心结束后，去除上清液，得到L2XIO7个PBMC;
[0071] 5)使用培养液重悬上述获得的PBMC，得到细胞悬液；所述培养液由IFN-y