虎皮兰黄酮及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及虎皮兰黄酮及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 虎皮兰，百合科，虎尾兰属，原产非洲西部，适应环境能力强，叶纤维强韧，可用于 编织。目前在我国各地均有种植，可作为室内观叶植物进行盆栽，因其能够很好的吸收室 内甲醛，可以净化空气，被人们称为"天然的清道夫"。研究表明，虎皮兰中含有常量元素 钙 172. 85mg/g、镁 42. 87mg/g、钾 0? 1212mg/g、钠 0? 0687mg/g，以及微量元素铁 0? 1066mg/ g，锰0. 0770mg/g，铜0. 0073mg/g，锌0. 0040mg/g，含有人体必需氨基酸的平均质量分数为 2.384% ;利用气相色谱-质谱、核磁共振结合的方法从虎尾兰中分离出了 12种留体皂苷。
[0003] 对虎皮兰的药理作用研究表明，虎皮兰在消炎、镇痛、止泻、抗过敏、缓解糖尿病等 方面具有一定的潜在作用。然而，虎皮兰作为天然植物，具有多种活性成分，明确某一种或 某几种活性成分的结构及其功能，对于深入挖掘虎皮兰的药理作用及其新药(或保健食品） 开发具有重要作用。
[0004] 黄酮类化合物在植物的活性成分中所占比例较大，五分之一的药用植物中含有较 高的黄酮类物质，药用价值及营养价值显著。近些年来，人们对黄酮的探究越来越深，发现 其药理作用广泛。一些黄酮类化合物已应用于实际生产，如从豆科类植物中分离出的大豆 异黄酮成分具有显著的降低胆固醇，降低心血管疾病发病率的功效，美国FDA于1999年已 将其推荐在健康食品中使用。
[0005] 鉴于尚未见虎皮兰中黄酮组分及其功效研究的报道或专利申请文件。本发明专利 研制了虎皮兰中黄酮类物质的提取、精制及检测方法，并证实了虎皮兰黄酮具有抑菌、抗氧 化、抑制肿瘤细胞生长等活性。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供虎皮兰黄酮。
[0007] 虎皮兰黄酮，它是用下述方法制备的：将虎皮兰干燥粉碎，乙醇提取；石油醚萃 取，弃石油醚层，乙酸乙酯萃取，挥干得到虎皮兰黄酮； 所述的乙醇提取为以体积分数为60%的乙醇作为提取剂，配制液料比为25 :1，浸泡过 夜，在80°C下，超声频率20-35HZ，功率90-100W，超声提取34min，抽滤； 将上述的虎皮兰黄酮溶于甲醇溶液中，加入15g硅胶拌样，充分搅拌后，在烘箱中 48°C-52°C挥干甲醇；将含有样品的硅胶加到硅胶柱柱顶，待硅胶粉沉淀表面平整，以氯 仿-甲醇溶液为洗脱液，流速为lmL/min进行梯度洗脱，得到洗脱峰标记为洗脱峰I、洗脱 峰II、洗脱峰III、洗脱峰IV; 合并收集洗脱峰II洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-b; 合并收集洗脱峰III洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-c; 合并收集洗脱峰IV洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-d。
[0008] 本发明的另一个目的是提供虎皮兰黄酮的应用。
[0009] 所述的虎皮兰黄酮在制备抗沙门氏菌和大肠杆菌药物中的应用。
[0010] 所述的虎皮兰黄酮TFS-b对羟自由基、DPPH自由基及超氧负离子的清除应用。
[0011] 所述的虎皮兰黄酮在制备治疗人宫颈癌细胞系Hela或小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0 的药物中的应用。
[0012] 所述的虎皮兰黄酮TFS-c或虎皮兰黄酮TFS-d在制备治疗人宫颈癌细胞系Hela 或小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0药物中的应用。
[0013] 本发明提供了虎皮兰黄酮，它是以新鲜的虎皮兰为原料，经过前处理得到干燥的 虎皮兰粉末；超声乙醇提取；再用石油醚、乙酸乙酯萃取获得；液料比25 :1溶于60%乙醇 中，超声时间34min、超声温度80 °C、超声功率90-100W，在该条件下虎皮兰黄酮的提取量 达最大值，为8. 501mg/g;经硅胶层析纯化，得到了虎皮兰黄酮的四个组分TFS-a、TFS-b、 TFS-c和TFS-d;虎皮兰黄酮粗制品，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌均有显著的抑制作用，对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制作用尤为明显，对大肠杆菌、沙门氏 菌、枯草芽孢杆菌的MIC均为3. 75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为7. 5mg/mL;虎皮兰黄 酮的四个组分TFS-a、TFS-b、TFS-c和TFS-d，均对羟自由基、DPPH自由基、超氧负离子具 有显著的清除作用，TFS-b的清除作用最强，清除率分别可达到59. 8%、78. 6%、84. 2% ;粗黄 酮及各黄酮组分对Hela细胞均有效果，尤其是TFS-c和TFS-d;TFS-a对小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0无作用效果，但粗黄酮和其他组分均可抑制SP2/0细胞生长，尤其是TFS-c和TFS-d; 另外，虎皮兰黄酮及其四种组分对人肺癌细胞系A549、喉癌细胞系Hep-2无明显效果，对正 常狗肾细胞DK几乎无伤害。
【附图说明】
[0014] 图1芦丁标准曲线； 图2虎皮兰黄酮的硅胶层析洗脱曲线； 图3虎皮兰黄酮定性检测层析图（乙酸乙酯：甲酸：水=8:3:1); 图4虎皮兰黄酮定性检测层析图（苯：乙酸乙酯：甲酸=8:4:2); 图5虎皮兰黄酮的抑枯草芽孢杆菌活性； 图6虎皮兰黄酮的抑大肠杆菌活性； 图7虎皮兰黄酮的抑金黄色葡萄球菌活性； 图8虎皮兰黄酮的抑沙门氏菌活性； 图9虎皮兰黄酮四个组分清除羟自由基活性； 图10虎皮兰黄酮四个组分清除DPPH自由基活性； 图11虎皮兰黄酮四个组分清除超氧负离子活性； 图12HeLa的细胞毒性作用（对照10X4); 图13虎皮兰黄酮TFS-a对HeLa的细胞毒性作用（10X4); 图14虎皮兰黄酮TFS-b对HeLa的细胞毒性作用（10X4); 图15虎皮兰黄酮TFS-c对HeLa的细胞毒性作用（10X4); 图16虎皮兰黄酮TFS-d对HeLa的细胞毒性作用（10X4) 图17虎皮兰黄酮对HeLa的细胞毒性作用（10X4); 图18SP2/0的细胞毒性作用(对照10X4); 图19虎皮兰黄酮TFS-b对SP2/0的细胞毒性作用（10X4); 图20虎皮兰黄酮TFS-c对SP2/0的细胞毒性作用（10X4); 图21虎皮兰黄酮TFS-d对SP2/0的细胞毒性作用（10X4); 图22虎皮兰黄酮对SP2/0的细胞毒性作用（10X4); 图23虎皮兰黄酮对A549的影响(对照10X4); 图24虎皮兰黄酮对A549的影响（10X4); 图25虎皮兰黄酮对H印-2的影响(对照10X4); 图26虎皮兰黄酮对H印-2的影响（10X4); 图27虎皮兰黄酮对DK的影响(对照10X4); 图28虎皮兰黄酮对DK的影响（10X4)。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1虎皮兰黄酮的提取工艺优化 (1)标准曲线制备 称取干燥充分并恒重的芦丁标准品0. 0050g，用浓度为60%的乙醇溶解，并定容至 50mL，获得浓度为0.lmg/mL的芦丁标准溶液。取上标准溶液0.OmL、1. 0mL、2. 0mL、3.OmL、 4. 0mL、5.OmL于6只lOmL刻度试管中，用60%乙醇补至5.OmL，加入0. 3mL5%(W/V)亚硝 酸钠溶液，摇匀，放置6min后加入0. 3mL10% (W/V)硝酸铝溶液，放置6min，再加入4.OmL lmol/L氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至刻度（再加0. 4mL60%的乙醇），常温放 15min后，测定其吸光度，空白对照取60%的乙醇加上述溶剂，绘制标准曲线，如图1。
[0016] (2 )虎皮兰黄酮含量计算方法 取新鲜虎皮兰，洗净后剪碎，冷却至室温5min、再于常压下蒸6-8min，置于干燥、通风 处阴干，用粉粹机粉碎后，过40目筛，即得干燥的虎皮兰粉末。称取干燥的虎皮兰粉末2. 0g 于50mL三角瓶中，按一定的液料比（V/m)加入乙醇溶液，按一定时间进行提取，抽滤。滤渣 以上述方法提取、抽滤，合并滤液，然后用适量的石油醚脱脂，得样