0029] (2)虎皮兰黄酮的DPPH自由基清除活性 分别取Vc和4种虎皮兰黄酮TFS-a、TFS-b、TFS-c、TFS-d溶于10mL蒸馏水中，配置溶 液浓度梯度为2、4、6、811^/11^;称量411^0??11自由基，采用无水乙醇配成0.0211^/11^的0??11 乙醇溶液。
[0030] 向试管里加入1. 0mL无水乙醇和4.OmLDPPH乙醇溶液，混匀，在517nm处测定吸 光度值，记为A0 ;加入4.OmL0. 02mg/mLDPPH乙醇溶液和1.OmL待测液，混匀，测定吸光度 值，记为A1 ;加入4.0mL无水乙醇和1.0mL待测液，混匀，测定吸光度值，记为A2。清除率 计算公式：清除率=1- (A1-A2) /A0。
[0031] 结果表明，如图10所示，四种虎皮兰黄酮均对DPPH有清除作用。Vc的半数清除 率为1. 69mg/mL，而TFS-b的半数清除率为1. 85mg/mL，两者极为接近。四种黄酮组分之中， TFS-b对DPPH的清除效果最好，清除率为78. 6%，TFS-a为59. 2%，TFS-c为48. 7%，TFS-d为 31. 2%〇
[0032] (3)虎皮兰黄酮的超氧负离子清除活性 分别取Vc和4种虎皮兰黄酮纯品TFS-a、TFS-b、TFS-c、TFS-d溶于10mL蒸馏水中，配 置溶液浓度梯度为2、4、6、8mg/mL。
[0033] 取4. 0mLTris-HCl缓冲液（0. 5mol/L、pH8. 2)于比色管中，25°C水浴锅加热20 min，分别加入不同浓度的待测品0. 4mL后，再加入4. 5mmol/L的邻苯三酸（由10mmol/L HC1配制)0. 6mL，混匀后25°C水浴中反应，4min后，立即加入10mmol/LHC1 2~3滴终止 反应，用蒸馏水调零，在326nm处测定吸光度度值A。清除率计算公式：清除率（％)= [1-(A !-A2)/A0 ]X100% 其中A。：不加样品只加邻苯三酚时的吸光度值A1:样品和邻苯三酚全加时的吸光度值 A2:不加邻苯三酚只加样品时的吸光度值 结果表明，如图11所示，四种虎皮兰黄酮组分均对超氧阴离子自由基有清除作用。Vc的半数清除率为1. 64mg/mL，TFS-b为1.85mg/mL，接近Vc水平。当纯品浓度为8.Omg/mL 时，TFS-b对超氧阴离子自由基的清除率为84. 2%，与Vc几乎相同，TFS-a、TFS-c、TFS-d对 超氧阴离子自由基的清除率分别为72. 4%、50. 3%、41. 5%。
[0034] 实施例6虎皮兰黄酮粗制品的抗肿瘤活性 (1)肿瘤细胞的培养 人宫颈癌细胞系HeLa、喉癌细胞系H印-2、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0、肺癌细胞系A549 为试验细胞，狗肾细胞系DK为正常细胞。培养细胞选用的是RPMI-1640培养基，在100mL 培养瓶中加入10mL细胞培养液，每过24h便换掉培养液，72h传代一次。传代时，旧的培养 液废弃，取3mL胰酶消化液消化贴壁细胞5min，振摇培养瓶，使贴壁细胞完全脱落，加入适 量培养液传代。在37°C、5%C02条件下培养。用3mL胰蛋白酶液消化细胞5min后，显微镜 下观察细胞形状，倒掉胰蛋白酶，加入3~5mL培养基，2000转离心5min，弃上层培养液，向底 部细胞加入新的培养液，吹打分散成单细胞悬液，按照每孔5000个细胞的量加入到96孔细 胞培养板中，放入C02浓度为5%，温度控制在37°C的培养箱中2h使之贴壁。
[0035] (2)细胞特异性毒性实验 分别取实施例2所述虎皮兰黄酮粗制品和TFS-a、TFS-b、TFS-c、TFS-d四个组分用无 菌PBS配置浓度为6mg/mL的溶液，待上述细胞培养24h后，向其中分别加入黄酮粗制品和 TFS-a、TFS-b、TFS-c、TFS-d四个组分，设置体积为10yL和20yL两个试验组，每组设置三 个平行。37°C、5%C02条件下培养48h，取出放于倒置显微镜下观察结果。
[0036] 结果表明，10yL和20yL虎皮兰黄酮粗制品对人宫颈癌细胞系Hela、小鼠骨髓瘤 细胞系SP2/0的生长均具有显著的抑制作用，而对人肺癌细胞系A549、喉癌细胞系H印-2和 正常细胞系DK的生长无显著差异。虎皮兰黄酮TFS-a高浓度组分对人宫颈癌细胞系Hela 的生长有抑制作用，而对人肺癌细胞系A549、喉癌细胞系H印-2、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0 和正常细胞系DK的生长无显著差异。虎皮兰黄酮TFS-b高浓度组分对人宫颈癌细胞系Hela 和小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的生长有抑制作用，而对人肺癌细胞系A549、喉癌细胞系H印-2 和正常细胞系DK的生长无显著差异。虎皮兰黄酮TFS-c和TFS-d组分对人宫颈癌细胞系 Hela、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的生长均具有显著的抑制作用，而对人肺癌细胞系A549、喉 癌细胞系H印-2和正常细胞系DK的生长无显著差异。如表3和图12~28所示。
[0037]表3.虎皮兰黄酮粗制品和各组分对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响
【主权项】
1. 虎皮兰黄酮，它是用下述方法制备的：将虎皮兰干燥粉碎，乙醇提取；石油醚萃取， 弃石油醚层，乙酸乙酯萃取，挥干得到虎皮兰黄酮。2. 根据权利要求1所述的虎皮兰黄酮，其特征在于：所述的乙醇提取为以体积分数为 60%的乙醇做为提取剂，配制液料比为25 :1，浸泡过夜，在80°C下，超声频率20-35HZ，功率 90-100W，超声提取34min，抽滤。3. 根据权利要求1或2所述的虎皮兰黄酮，其特征在于：所述的虎皮兰黄酮溶于甲醇 溶液中，加入15g硅胶拌样，充分搅拌后，在烘箱中48 °C -52 °C挥干甲醇；将含有样品的硅胶 加到硅胶柱柱顶，待硅胶粉沉淀表面平整，以氯仿-甲醇溶液为洗脱液，流速为lmL/min进 行梯度洗脱，得到洗脱峰标记为洗脱峰I、洗脱峰II、洗脱峰III、洗脱峰IV ; 合并收集洗脱峰II洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-b ; 合并收集洗脱峰III洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-c ; 合并收集洗脱峰IV洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到虎皮兰黄酮TFS-d。4. 权利要求1所述的虎皮兰黄酮在制备抗沙门氏菌和\或大肠杆菌药物中的应用。5. 权利要求3所述的虎皮兰黄酮TFS-b对羟自由基、DPPH自由基、超氧负离子的清除 应用。6. 权利要求1所述的虎皮兰黄酮在制备治疗人宫颈癌细胞系Hela或小鼠骨髓瘤细胞 系SP2/0的药物中的应用。7. 权利要求3所述的虎皮兰黄酮TFS-c或虎皮兰黄酮TFS-d在制备治疗人宫颈癌细胞 系Hela或小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了虎皮兰黄酮，它是以新鲜的虎皮兰为原料，经过前处理得到干燥的虎皮兰粉末；超声乙醇提取；再用石油醚、乙酸乙酯萃取获得；经硅胶层析纯化，得到了虎皮兰黄酮的四个组分TFS-a、TFS-b、TFS-c和TFS-d；虎皮兰黄酮，对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制作用明显，MIC均为3.75mg/mL；虎皮兰黄酮TFS-b对羟自由基、DPPH自由基、超氧负离子具有显著的清除作用，分别为59.8%、78.6%、84.2%；虎皮兰黄酮及虎皮兰黄酮TFS-c和TFS-d组分对人宫颈癌细胞系Hela、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的生长均具有显著的抑制作用，而对人肺癌细胞系A549、喉癌细胞系Hep-2和正常细胞系DK的生长无显著差异。
【IPC分类】C07H1/08, A61P39/06, A61P35/00, A61P31/04, A61K31/7048, C07H17/07
【公开号】CN105153255
【申请号】CN201510577066
【发明人】李泽鸿, 刘莹, 钟月姣, 张继元, 刘树英, 赵福广, 张文慧, 刘洪章, 马丽华, 薛英, 刘楚含, 刘回民
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月13日