一种建兰组培快速繁殖方法
【专利摘要】本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种建兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：植株预处理、材料选取、材料消毒、诱导培养、丛生芽继代增殖培养、生根壮苗培养及移栽，通过本发明采用的外植体和消毒方法，能大大提高外植体的诱导率，同时培养后的苗株成苗率高，长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养建兰提供了技术支持。
【专利说明】
一种建兰组培快速繁殖方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种建兰组培快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 建兰是地生植物，生于疏林下、灌丛中、山谷旁或草丛中，海拔600-1800米。产中国 安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东、海南、广西、四川西南部、贵州和云南。广泛分布于 东南亚和南亚各国，北至日本。目前大多采用的繁殖方式是分株繁殖，而且很少形成种子， 种子发育也比较困难，基本上在自然条件下萌发的难度比较大，因此建兰高效繁殖的主要 手段就是组织培养。国外一些发达国家采用工厂化育苗技术以及组织培养快繁技术，不仅 可以创造巨大的经济效益，同时也培育了很多优良品种，然而我国关于建兰组织培养的快 繁技术研究仍然处于初级阶段，在很大程度上阻碍了建兰的规模化生产。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种消毒效果好、成苗率高的建兰组培快速繁殖方法。
[0004] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为:一种建兰组培快速繁殖方法，包括 以下步骤：
[0005] (1)植株预处理:将叶长为10~12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培 养温度20~22°C，光照时间为15h/d，光照强度为4000~50001x，培养时间50~60天；
[0006] (2)材料选取:建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植 株中未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部 节位上的花梗芽作为外植体；
[0007] (3)材料消毒:将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5~1 Omin，冲洗后将 外植体放置在洗洁精水中浸泡lOmin并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用 体积分数为75 %的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗芽上的苞叶 去除，用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75%的酒精棉球擦拭 外植体，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗节段用质量分数为2%的过氧化氢溶液消毒两次， 每次消毒时间为5~lOmin，且每次消毒后用灭菌水清洗4~5遍；
[0008] (4)诱导培养:切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行 预培养，培养时间为22~25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，培养温度均为23~25 °C，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000~25001x;所述诱导培养基为：l/3MS+3~ 5mg/L 6-BA+0 · 5~1 · 5g/L活性炭+0 · 3~0 · 5mg/LNAA+15 % 椰汁+30~40mg/L柠檬酸+22~ 27g/L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 4~5 · 5;
[0009] (5)丛生芽继代增殖培养:将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到 继代培养基上，所述继代培养基为:B5+8~12mg/L KT+0.1~0.3mg/L 2,4_二氯苯氧乙酸+ 140~160g/L香蕉泥+90~110mg/L柠檬酸+28~32g/L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 1~5 · 4，培 养温度23~25°C，光照时间为14h/d，光照强度为2000~25001x;
[0010] (6)生根壮苗培养:继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗 转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为:MS+3~6mg/LKT+0.5~0.8mg/L NAA+140~ 160g/L香蕉泥+90~1 lOmg/1柠檬酸+28~32g//L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 5~5 · 7，培养时 间为15~20d，培养温度23~25°C，光照时间为12h/d，光照强度为2000~25001x;
[0011] (7)移栽：当试管苗生长至4~5cm高，根2~4条，叶1~2片时，将试管苗放在自然光 下炼苗5~7天，打开瓶盖炼苗1~2天;然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基， 清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1: 2的混合基质中，保持湿度 和通风，空气湿度为75~85%，温度为20~25°C。
[0012] 如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述诱导培养基为：1/ 3MS+4mg/L 6-BA+lg/L活性炭+0.4mg/L NAA+15%椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+8g/L琼 脂。
[0013] 如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述继代培养基为:B5+ 10mg/L KT+0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+15(^凡香蕉泥+10〇11^凡梓檬酸+3(^凡食糖+8区凡 琼脂。
[0014] 如上所述的一种建兰组培快速繁殖方法，进一步说明为，所述壮苗培养基为:MS+ 5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/L梓檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
[0015] 本发明的有益效果是:通过本发明采用的外植体和消毒方法，能大大提高外植体 的诱导率，同时培养后的苗株成苗率高，长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了 商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养建兰提供了技术支持。
【具体实施方式】
[0016] 下面对本发明【具体实施方式】做进一步的阐述。
[0017] 本发明提供的一种建兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0018] (1)植株预处理:将叶长为10~12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培 养温度20~22°C，光照时间为15h/d，光照强度为4000~50001x，培养时间50~60天;通过一 段时间的预处理，能够得到更好品质的花梗，使接下来的组织培养效果更好。
[0019] (2)材料选取:建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植 株中未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部 节位上的花梗芽作为外植体;分别切取花梗上不同部位的花梗芽做样本，放置在普通诱导 培养基上进行诱导培养；
[0020] 表1为花梗上不同部位对花梗芽萌芽的影响
[0021]
[0022]由表1可以看出，上部花梗芽和中部花梗芽的萌芽率都较高，但是上部花梗芽的芽 健壮情况一般，所以采用花梗中部的花梗芽最好，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植 体，能有效提高生产率和质量。
[0023] (3)材料消毒:将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5~lOmin，冲洗后将 外植体放置在洗洁精水中浸泡lOmin并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用 体积分数为75 %的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗芽上的苞叶 去除，用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75%的酒精棉球擦拭 外植体，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗节段用质量分数为2%的过氧化氢溶液消毒两次， 每次消毒时间为5~lOmin，且每次消毒后用灭菌水清洗4~5遍;采用过氧化氢溶液分两次 消毒，这样可以能较好起到灭菌作用的同时而又对其活性影响较小；
[0024] 表2为不同消毒剂及消毒次数对花梗芽污染率和萌芽率的影响
[0025]
上述经过消毒剂的花梗芽均接种到相同普通诱导基上进行培养，然后得出污染率 和萌芽率，由表2可以看出，采用质量分数为2%的过氧化氢溶液消毒效果要好于质量分数 为2%的NaCIO溶液，同时可以看出分两次进行消毒，虽然污染率要高于一次消毒，但是分两 次进行消毒后的萌芽率大大提高，故采用质量分数为2%的过氧化氢溶液消毒两次，能更好 的对建兰花梗芽进行消毒时，提高花梗芽的萌芽率。
[0027] (4)诱导培养:切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行 预培养，培养时间为22~25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，通过一段时间的暗培 养，能一定程度上有效抑制褐化现象，培养温度均为23~25°C，光培养时，光照时间为12h/ d，光照强度为2000~25001x;所述诱导培养基为：1/3MS+3~5mg/L 6-BA+0 · 5~1 · 5g/L活性 炭+0 · 3~0 · 5mg/L NAA+15 %椰汁+30~40mg/L柠檬酸+22~27g/L食糖+5~9g/L琼脂，pH为 5.4~5.5;通过加入抗氧化剂柠檬酸和吸附剂活性炭，更能进一步抑制褐化现象的产生； [00 28]表3为诱导培养基成分及用量
[0029]
[0030] 作为优选，所述诱导培养基为：l/3MS+4mg/L 6-BA+lg/L活性炭+0.4mg/LNAA+15% 椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+8g/L琼脂，即为表3中诱导培养基1的成分及用量；
[0031 ]表4为基础培养基的用量不同对花梗芽萌芽率的影响
[0032]
[0033]由表4可以看出，适当降低MS基础培养基的大量元素浓度，可以提高建兰花梗芽的 萌芽率，当MS基础培养基浓度过低时，又不满足花梗芽的吸收需要，所以本诱导培养基采用 1/3MS作为基础培养基，所述MS培养基的成分为公知技术，这里不做详细阐述。
[0034] (5)丛生芽继代增殖培养:将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到 继代培养基上，所述继代培养基为:B5+8~12mg/L KT+0.1~0.3mg/L 2,4_二氯苯氧乙酸+ 140~160g/L香蕉泥+90~110mg/L柠檬酸+28~32g/L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 1~5 · 4，培 养温度23~25°C，光照时间为14h/d，光照强度为2000~25001x;
[0035]表5为继代培养基成分及用量 [0036]
[0037] 作为优选，所述继代培养基为:B5+10mg/L KT+0.2mg/L 2,4_二氯苯氧乙酸+150g/ L香蕉泥+100mg/L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂，即为表5中继代培养基1的成分及用量。 [0038] (6)生根壮苗培养:继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗 转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为:MS+3~6mg/L KT+0.5~0.8mg/L NAA+140~ 160g/L香蕉泥+90~1 lOmg/1柠檬酸+28~32g//L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 5~5 · 7，培养时 间为15~20d，培养温度23~25°C，光照时间为12h/d，光照强度为2000~25001x;
[0039]表6为壮苗培养基成分及用量
[0040]
[0041 ] 作为优选，所述壮苗培养基为:MS+5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/ L柠檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂，即为表6中壮苗培养基1的成分及用量。
[0042] (7)移栽：当试管苗生长至4~5cm高，根2~4条，叶1~2片时，将试管苗放在自然光 下炼苗5~7天，打开瓶盖炼苗1~2天;然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基， 清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1: 2的混合基质中，保持湿度 和通风，空气湿度为75~85%，温度为20~25°C。通过本发明能使培养后的苗株成苗率高， 长势良好，同时通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、 产业化培养建兰提供了技术支持。
[0043] 本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术 人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。
【主权项】
1. 一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 植株预处理:将叶长为10~12cm的成熟株母本，放置在培养室中进行培养，培养温 度20~22°C，光照时间为15h/d，光照强度为4000~50001x，培养时间50~60天； (2) 材料选取:建兰预处理后，选取生长健壮及无病虫害长势良好的建兰，剪取植株中 未开花或正在开花的花梗，剔除花梗上已开放的花朵及未开放的花蕾，切取花梗中部节位 上的花梗芽作为外植体； (3) 材料消毒:将外植体用清水冲洗表面的泥沙，冲洗时间为5~lOmin，冲洗后将外植 体放置在洗洁精水中浸泡lOmin并用软刷毛刷去表面污垢，用清水冲洗30min，然后用体积 分数为75 %的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗芽上的苞叶去除， 用手术刀把花梗节与芽相处的苞叶剔除干净，在用体积分数为75%的酒精棉球擦拭外植 体，用灭菌水清洗2~3遍，再将花梗节段用质量分数为2%的过氧化氢溶液消毒两次，每次 消毒时间为5~lOmin，且每次消毒后用灭菌水清洗4~5遍； (4) 诱导培养:切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培 养，培养时间为22~25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，培养温度均为23~25 °C，光 培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000~25001x;所述诱导培养基为：1/3MS+3~5mg/L 6-BA+0 · 5~1 · 5g/L活性炭+0 · 3~0 · 5mg/L NAA+15%椰汁+30~40mg/L柠檬酸+22~27g/L食 糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 4~5 · 5; (5) 丛生芽继代增殖培养:将诱导培养后萌发的小芽，自基部剥离切割后，接种到继代 培养基上，所述继代培养基为:B5+8~12mg/L KT+0.1~(h3mg/L 2,4_二氯苯氧乙酸+140~ 16(^/1香蕉泥+90~11〇11^/1柠檬酸+28~328/1食糖+5~9 8/1琼脂，？!1为5.1~5.4，培养温 度23~25°C，光照时间为14h/d，光照强度为2000~25001x; (6) 生根壮苗培养:继代增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入 壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为:MS+3~6mg/L KT+0.5~0.8mg/L NAA+140~160g/L 香蕉泥+90~110mg/L柠檬酸+28~32g/L食糖+5~9g/L琼脂，pH为5 · 5~5 · 7，培养时间为15 ~20d，培养温度23~25°C，光照时间为12h/d，光照强度为2000~25001x; (7) 移栽：当试管苗生长至4~5cm高，根2~4条，叶1~2片时，将试管苗放在自然光下炼 苗5~7天，打开瓶盖炼苗1~2天;然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗 时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通 风，空气湿度为75~85%，温度为20~25°C。2. 根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基 为：l/3MS+4mg/L 6-BA+lg/L活性炭+0.4mg/L NAA+15%椰汁+35mg/L柠檬酸+25g/L食糖+ 8g/L琼脂。3. 根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述继代培养基 为:B5+10mg/L KT+0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+150〖凡香蕉泥+10〇11^凡梓檬酸+30〖凡食糖 +8g/L琼脂。4. 根据权利要求1所述的一种建兰组培快速繁殖方法，其特征在于：所述壮苗培养基 为:MS+5mg/L KT+0.6mg/L NAA+150g/L香蕉泥+100mg/L梓檬酸+30g/L食糖+8g/L琼脂。
【文档编号】A01H4/00GK106069772SQ201610545973
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】姚胜琼, 陈泽彬
【申请人】成都东山兰韵农业有限公司