时，本实施例中的正向外引物TS-F3，反向外引物TS-B3还可W作为PCR的引物， 通过PCR扩增，用于鉴定和检测相橘半穿刺线虫。 W65] 实施例2 :
[0066] 一种本发明的用于检测相橘半穿刺线虫的LAMP检测试剂盒，包括：
[0067] (1)引物组合物：〇. 5yM的正向外引物TS-F3、0. 5yM的反向外引物TS-B3、4yM 的正向内引物TS-FIP、4yM的反向内引物TS-BIP，1. 0yM的环引物TS-LB; W側似8U/yL的DNA聚合酶；
[0069] (3)反应缓冲液：200mM的Tris-肥 1(pH8. 8)、IOOmM的KC1、IOOmM的（畑4)S〇4、 60mM的M拆〇4、lwt% 的TritonX-100。
[0070] 其制备方法为：取1yL引物混合液、2. 5yL反应缓冲液、3yLdNTPs、1yLBst DNA聚合酶混合，用灭菌双蒸馈水补足体积至24yL。 阳〇7U 实施例3:
[0072] 一种本发明实施例2的LAMP检测试剂盒在检测±壤中相橘半穿刺线虫中的应用， 其具体的应用方法包括W下步骤： 阳〇7；3] (1)提取±壤DNA:采取相橘根际±壤，使用MP Biomedicals公司的化31:孤1法** Spin Kit化rSoil试剂盒提取±壤DNA(具体操作方法参见试剂盒说明书）；
[0074] 似制备LAMP反应体系：取1yL步骤（1)中的±壤DNA，加入到24yL实施例2 的LAMP检测试剂盒中，混匀得到25yLLAMP反应体系。 阳〇7引做LAMP反应：将步骤似中得到的反应体系置于63°C(60°C~65°C均可实施） 恒溫水浴中等溫扩增75min(30~90min均可实施），然后在82°C下保溫5min终止反应，得 到扩增产物。
[0076] (4)巧光检测：向步骤做中得到的扩增产物中加入2yL显色剂（显色剂为SYBR greenI与PCR级DMSO的混合物，体积比为1 : 9)。轻甩离屯、管后观察颜色变化。 阳077] 空白对照：用1yL灭菌双蒸馈水替代1yL±壤DNA，按照上述相同的方法进行 LAMP反应。
[0078] 检测结果参见图2,从图2中可知：从±壤中提取的DNA，经过LAMP扩增后得到的 扩增产物，显示为绿色，证明样本中含有相橘半穿刺线虫；而空白对照管中显示为红褐色， 证明样本中不含有相橘半穿刺线虫。
[0079] 妨电泳检测：取2化步骤做中得到的扩增产物，于2%琼脂糖凝胶中电泳，在 紫外光下检测结果。
[0080] 检测结果参见图3,从图3中可知：从±壤中提取的DNA，经过LAMP扩增后得到的 扩增产物，在凝胶电泳中显示梯状条带，表明样品中含有相橘半穿刺线虫；而空白对照经琼 脂糖凝胶电泳后，不显示梯状条带，证明样本中不含有相橘半穿刺线虫。
[0081] LAMP扩增反应结束后既可W进行巧光检测，也可W进行电泳检测，或者两种方法 可W同时进行。通过巧光检测可W肉眼鉴别样品中是否含有相橘半穿刺线虫，而电泳检测 一方面可W鉴别样品中是否含有相橘半穿刺线虫，还可W验证巧光检测的可靠性。 阳O間实施例4 :相橘半穿刺线虫LAMP特异性检测
[0083] 收集北方根结线虫、咖啡短体线虫、双宫螺旋线虫、燕麦滑刃线虫、丝尾垫刃线虫、 拟滑刃线虫、小杆目线虫、南方根结线虫、隐皮抱囊线虫、矮化线虫、旱稻抱囊线虫、松材线 虫，分别提取其DNA作为模板与相橘半穿刺线虫DNA模板，按照实施例3的方法进行LAMP 检测，W验证相橘半穿刺线虫LAMP检测方法的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体 种类及来源。
[0084] 表1 :供试的全部植物线虫群体种类及来源
[0086] 图4为巧光检测结果，其中编号1至13采用表1中的供试样本，编号14为阴性对 照。从图4中可知：仅有第1管中（相橘半穿刺线虫）显示为绿色，其余12个样本和阴性 对照均为红褐色。
[0087] 图5为电泳检测结果，其中编号1至13采用表1中的供试样本，编号14为阴性对 照。从图5中可知：第1泳道（相橘半穿刺线虫）出现LAMP特征性梯状条带，其它泳道均 未出现扩增条带。
[0088] 结果表明本发明所述的LAMP引物和LAMP检测方法在检测相橘半穿刺线虫是具有 很高的特异性。
[0089] 实施例5 :相橘半穿刺线虫LAMP灵敏度检测。
[0090] 取〇.5邑±壤，该±壤中含有100条相橘半穿刺线虫2龄幼虫。按照实施例3的方法 获得±壤总DNA，按10倍梯度稀释成9个浓度，则每0. 5g±壤中分别含有100~1. 0X10 6 条2龄幼虫。取各浓度的DNA1yL做为LAMP反应模板，按照实施例3的操作步骤进行LAMP 扩增反应得到LAMP扩增产物。
[0091] 同时W上述梯度稀释的DNA为模板，WTS-F3和TS-B3为引物，进行常规PCR检 ，体系如下JOXEasyhqBuffer(含Mg2〇 :3yL;2.5mMdNTPs:2yL;引物TS-F3 和 TS-B3 (10Jimol/L)各 1JiL;5U/JiLEasyTaqDNAPolymerase:0. 5JiL;模板DNA:1JiL;补 足d地2〇至25yL。PCR扩增条件为94°C预变性4min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸30s，35个循环；72°C延伸5min;4°C保存。得到PCR扩增产物。
[0092] 分别将LAMP扩增产物按照实施例3的方法进行巧光检测和电泳检测。
[0093] 巧光检测结果参见图6,其中1~10分别为：100、10、1、10 1、10 2、10 3、10 4、10 5、 10 6和阴性对照，从图6中可知：第1~5管均可W观察到绿色巧光，其它管和阴性对照均 为红褐色。
[0094] 琼脂糖凝胶电泳结果参见图7,其中1~10分别为：100、10、1、10 1、10 2、10 3、10 4、 10 5、10 6和阴性对照，从图7中可知：第1~5泳道均出现LAMP特征性梯状条带，其它泳道 均未出现扩增条带。
[00河从图6和图7中可知：采用LAMP方法检测相橘半穿刺线虫，其灵敏度检测能达到 0.Ol条线虫。
[0096] 分别将PCR扩增产物按照相同的方法进行脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见图8， 图8中1~10分别为：100、10、1、10 1、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6和阴性对照。从图8中可知； 在DNA稀释至0. 1条线虫时，能够观察到扩增条带，继续稀释时则观察不到扩增条带表明常 规PCR检测灵敏度为0. 1条线虫。
[0097] 图中，M表不Trans2KPlusIIDNAMarker。 阳09引 W上结果说明：本发明所述的LAMP引物和LAMP检测方法在0. 5g±壤中能够检测 到0.Ol条相橘半穿刺线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR灵敏度高10倍。
[0099] W上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽 然本发明已W较佳实施例掲示如上，然而并非用W限定本发明。任何熟悉本领域的技术人 员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述掲示的方法和技术内 容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对W上实施例所做的任何简单 修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物，其特征在于，包括正向外引物TS-F3， 反向外引物TS-B3,正向内引物TS-FIP，反向内引物TS-BIP，环引物TS-LB，所述正向外引物 TS-F3的DNA序列为SEQIDNO. 1所述的DNA序列，所述反向外引物TS-B3的DNA序列为 SEQIDNO. 2所述的DNA序列，所述正向内引物TS-FIP的DNA序列为SEQIDNO. 3所述的 DNA序列，所述反向内引物TS-BIP的DNA序列为SEQIDNO. 4所述的DNA序列，所述环引物 TS-LB的DNA序列为SEQIDNO. 5所述的DNA序列。2. -种权利要求1所述引物组合物在检测柑橘半穿刺线虫中的应用。3. -种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反 应缓冲液。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物包括0. 5yM的正向外 引物TS-F3、0. 5yM的反向外引物TS-B3、4yM的正向内引物TS-FIP、4yM的反向内引物 TS-BIP和LOyM的环引物TS-LB。5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为IOmM;所述DNA聚 合酶的浓度为8U/yL。6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括200mM的 Tris-HClUOOmM的KClUOOmM的（NH4)S04、60mM的MgS04、lwt% 的TritonX-IOO07. 根据权利要求3至6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括显色 剂，所述显色剂包括体积比为1 : 9的SYBRgreenI和DMS0。8. -种权利要求3至7中任一项所述试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫中的应用，其特征 在于，所述应用方法为： (1) 提取待检样品的土壤DNA; (2) 以提取的土壤DNA为模板，利用试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物； (3) 检测土壤样品中是否含有柑橘半穿刺线虫。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，LAMP扩增条件具体为：在60~65 °C温育 30~90min，然后82°C保温5min终止反应。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述步骤（3)中所述检测方法为以 下A、B中的一种或两种： A:向扩增产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察颜色变化，如果显示为绿色表示检测 为阳性，表明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果显示为红褐色表示检测结果为阴性，则 土壤样品中不含有柑橘半穿刺线虫； B:取扩增产物于2 %琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测结果，如果显示梯状条带，表 明土壤样品中含有柑橘半穿刺线虫，如果不显示梯状条带，则土壤样品中不含有柑橘半穿 刺线虫。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用，其中引物组合物包括正向外引物TS-F3，反向外引物TS-B3，正向内引物TS-FIP，反向内引物TS-BIP，环引物TS-LB。试剂盒包括上述引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。本发明的引物组合物及由其组成的试剂盒可应用于柑橘半穿刺线虫的快速诊断和鉴别，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷等优势。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105219879
【申请号】CN201510785871
【发明人】宋志强, 成飞雪, 刘勇, 张德咏, 罗源华, 程菊娥
【申请人】湖南省植物保护研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月16日