Peg化亮丙瑞林的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及PEG修饰的亮丙瑞林药物偶合物及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 亮丙瑞林是人工合成的黄体生成激素释放激素（LHRH，亦名促性腺激素释放激素， GnRH)的高活性衍生物，是GnRH拮抗剂，为多肽类药物。它可以刺激垂体分泌促性腺激素， 诱发生殖器官生成类固醇。长期大量使用会抑制垂体分泌促性腺激素及睾丸或卵巢留类的 生成，可治疗或缓解多种性激素依赖性疾病如前列腺癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、性早 熟等。
[0003] 目前亮丙瑞林的缓控释微球注射液在临床上得以应用，其高分子载体材料为 PLGA，属于混悬剂，最常用的制备方法是复乳法（w/o/w法），其应用存在一些不足：微球粒 径范围一般为1~500μm，小的可以是几纳米，大的可达800μm，所需注射针头较粗，注射 部位会有疼痛、硬结或发红等刺激；微球的粒径不均一，药物释放受影响；若材料降解性不 好易引起炎症反应，患者顺应性较差；只作为皮下给药，静脉注射可能会引起血栓形成。
[0004] 聚乙二醇（PEG)由多个重复的氧乙烯基组成，是一种两亲性良好的聚合物。其化 学性质稳定，无抗原性，毒性小，且生物相容性已通过FDA认证。作为修饰剂与蛋白质或多 肽类药物结合后，许多优良性能随之转移到PEG化后的药物中。与蛋白质或多肽结合时，可 作为一种屏障遮挡住其分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生，或者阻止抗原与抗体的 结合，抑制免疫反应的发生，即降低免疫原性和免疫反应性。PEG化后的药物分子增大，肾小 球过滤减少，有助于蛋白质或多肽类药物循环半衰期的延长。蛋白质或多肽在经水溶性的 PEG大分子修饰后，热稳定性、抗酸碱能力、抗变性剂能力及抗酶解能力均有明显提高，稳定 性增强。经PEG修饰后的蛋白质或多肽，毒性比修饰之前低，不少修饰的蛋白质的药效还有 明显提高。此外，蛋白质或多肽经PEG修饰后可以制备成各种剂型直接给药，既与微球一样 达到缓释的目的，又减少了副作用，提高了患者的顺应性。
[0005] 目前已有多种通过FDA批准进入市场的PEG修饰的蛋白质和多肽药物，如PEG修 饰的腺苷脱氢酶（PEG-ADA)、PEG修饰的天冬酰胺酶（PEG-asparaginase)、PEG修饰的干扰 素a-2a(peginterferonalfa_2a)、PEG修饰的干扰素a-2b(peginterferonalfa_2b)、 PEG修饰的重组人粒细胞集落刺激因子等。
[0006]PEG在与蛋白质或多肽结合之前需要进行活化。PEG功能基团为其末端的羟基，反 应活性低，只能在较剧烈的条件下与其他基团结合，可能会使蛋白质或多肽失活，因此，必 需将PEG进行活化，以便在温和的条件下，以较高的反应速率与蛋白质或多肽偶联。
[0007]蛋白质或多肽分子中存在多个氨基，偶合后得到的产物通常是多种交联产物的混 合物，而且PEG的分子大小及分子结构，对修饰后的蛋白质或多肽空间结构、稳定性及活性 方面均有影响。亮丙瑞林的PEG偶合物目前还没有相关研究。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种PEG-亮丙瑞林偶联物及其制备方法，目的在于保持亮丙瑞林活 性的前提下，提高药物的稳定性，增加药物的缓释作用，减轻过敏反应，具有用药更安全、更 长效的功能。
[0009] 具体地，本发明在于提供一种在亮丙瑞林Ser残基上的羟基进行PEG化的PEG-亮 丙瑞林偶合物，所述偶合物具有如下通式：
[0010] R0-(CH2CH20)n-Mal-Leuprorelin或其分支型
[0011] 式中，R为Η或C1~C4烷基，优选为甲基；
[0012] η为100到1000整数值，优选为200~500之间的整数，聚乙二醇的分子量在5~ 40kDa之间，优选为20kDa。
[0013] 具体地，先将PEG与马来酸酐连接，再形成活泼酯，然后通过化学方法以共价键 偶联到带保护的亮丙瑞林上，经TFA溶液去保护，形成通式为D-L的偶合物，其中D为 PEG-Mal，L为亮丙瑞林。
[0014] 具体地，该偶合物为单一位点修饰的PEG-Mal偶合物。
[0015] 本发明中，所述与亮丙瑞林偶联的聚乙二醇为琥珀酰亚胺基活化的单甲氧基聚乙 二醇。聚乙二醇分子根据偶联度不同，可以是分子量为5~40KDa的任一分子，其中优选分 子量为20kDa的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或 多链。优选直链型单链聚乙二醇分子。
[0016] 本发明PEG-亮丙瑞林偶联物中，亮丙瑞林既包括亮丙瑞林，也包括醋酸亮丙瑞 林。
[0017] 另外本发明还提供了该偶合物的制备方法，其工艺如下：
[0018]
【附图说明】
[0019] 图1为PEG化亮丙瑞林大鼠体内药代动力学试验结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详述，但是本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0021] 实施例1制备PEG-Mal-亮丙瑞林
[0022] 1. 1PEG-MAL样品（2)的制备
[0023] 将不同分子量的单甲氧基聚乙二醇PEG分别溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量 的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60°C，反应8h，浓缩，异丙醚析晶体得到不同 分子量的一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇。
[0024] 1. 2PEG-MAL-OSu样品（3)的制备
[0025] 将不同分子量的一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇PEG-MAL分别溶于适量的THF， 加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗 涤，真空干燥得不同分子量的PEG-MAL-OSu。
[0026] 1. 3PEG-Mal-ProLeuprorelin样品（5)的制备
[0027] 用100mMpH5. 5的NaH2P04-H3P0#l冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/ mL的溶液，分别与不同分子量的聚乙二醇修饰剂PEG-MAL-OSu进行修饰，ProLeuprorelin: PEG-MAL-OSu为1:5的摩尔比进行反应，在4°C下反应24h后，加入1M的甘氨酸终止反应， 经葡聚糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物。
[0028] 1. 4PEG-Mal-Leuprorelin样品（6)的制备
[0029] 不同分子量的聚乙二醇修饰剂PEG-MAL-ProLeuprorelin分别加入至 TFA:Tis:H20(95:2. 5:2. 5)的溶液中，室温搅拌3~5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶 Superdex200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。
[0030] 实施例2PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰条件
[0031] 1、反应pH值对修饰产物的影响
[0032] 取带保护的亮丙瑞林，分别用100mmol/LPB缓冲液（pH4. 0、pH5. 0、pH5. 5 和pH6· 0)配成 2mg/mL。按摩尔比l:3(ProLeuprorelin:PEG-MAL-〇Su_2〇KD)称 取PEG-MAL-0SU-20KD加入亮丙瑞林反应溶液中，4 °C条件下lOOrprn搅拌反应24h， 加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，加入至 TFA:Tis:H20(95:2. 5:2. 5)的溶液中，室温搅拌3~5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝 胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确定 PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。
[0033] 实验结果表明：pH值在4. 0、5. 0、5. 5、6. 0的条件下，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例 分别为19 %，30 %，60 %，23 %。说明pH4. 0的修饰率最低，pH5. 5的条件下修饰率最高。
[0034] 2、亮丙瑞林与PEG的修饰比例对修饰产物的影响
[0035] 取带保护的亮丙瑞林，分别用pH5. 5,100mmol/LPB缓冲液配成2mg/mL。按 ProLeuprorelin:PEG-MAL-0Su-20KD摩尔比A(l:l)、B(l:2)、C(l:3)、D(l:4)、E(l:5)、 F(l:8)、G(1:10)分别称取PEG-MAL-0Su-20KD加入亮丙瑞林反应溶液中，4°C条件下lOOrpm 搅拌反应24h，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩， 加入至TFA:Tis:H20 (95:2. 5:2. 5)的溶液中，室温搅拌3~5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚 糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确 定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。
[0036]实验结果表明：ProLeuprorelin:PEG-MAL-0Su-20KD摩尔比A(l: 1)、B(l:2)、 C(1:3)、D(1:4)、E(1:5)、F(1:8)、G(1:10)时，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例分别为 17%， 29%，39%，45%，60 %、62%，61 %。当ProLeuprorelin:PEG-MAL-0SU-20KD摩尔比达到 1:5 后，不能进一步提尚修饰率。
[0037] 3、反应温度和时间对修饰产物的影响
[0038] 取带保护的亮丙瑞林溶液，分别用pH5. 5,100mm〇l/LPB缓冲液配成2mg/mL，按 ProLeuprorelin:PEG-MAL-0SU-20KD摩尔比 1:5 称取PEG-MAL-0SU-20KD加入亮丙瑞林反应 溶液中，分别在4°C反应24h，25°C反应12h不同时间点，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚 糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，加入至TFA:Tis:H20 (95:2. 5:2. 5)的溶液中，室温 搅拌3~5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex200柱层析纯化，浓缩，冷冻干 燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。
[0039] 实验结果表明：4°C条件下通过延长反应时间，同样能达到25°C条件下反应的修 饰率。但4°C条件修饰更利于亮丙瑞林的活性和结构稳定。
[0040] 4、ProLeuprorelin浓度对修饰产物的影响
[0041] 取带保护的亮丙瑞林溶液，分别用pH5. 5，100mmol/LPB缓冲液配成l.Omg/ mL，2. 0mg/mL，3. 0mg/mL，4. 0mg/mL按ProLeuprorelin与PEG-MAL-〇Su_20KD摩尔