（d)时）。可使用核 酶破坏对应于目标基因的mRNA，所述核酶在位点特异性识别序列处切割所述mRNA，但优选 使用键头状核酶。构建键头状核酶的方法可参见例如化seloffandGerlach，1988,化化 re, 334:585-591。
[0115]W与在反义方法中相同的方式，例如为了改善稳定性和祀向表现，核酶构建可使 用修饰的寡核巧酸。为了在目标细胞中产生有效量的核酶，优选包括编码核酶的DNA的核 酸构建体在启动子的控制下使用，所述启动子在昆虫细胞中作用强烈（例如actin启动子 或iel启动子）。
[0116] 沈QIDNO. 1示出编码魏豆晒中甜P的mRNA序列（NA647-4776)的一部分（SEQ IDNO. 1)ο
[0117]沈QIDΝ0:2 是来自沈QIDNO. 1 的dsRNA。
[011引SEQIDNO:3是克隆dsRNA产生载体后的质粒核酸序列。
[0119] 沈QIDNO:4是魏豆晒SHP中包含的氨基酸序列。
[0120]SEQIDN0:5是麦长管晒SHPmRNA中包含的核酸序列，SEQIDN0:6是编码蛋白 中包含的对应的氨基酸序列。
[012。 沈QIDN0:7是麦无网长管晒SHPmRNA中包含的核酸序列，沈QIDN0:8是编码 蛋白中包含的对应的氨基酸序列。
[0122] 化核酸组合物和构建体
[0123] 本发明提供DNA构建体，用于实现稳定转化特定的害虫目标宿主或共生生物。转 化的害虫目标宿主或共生生物可由重组DNA构建体表达有效杀虫水平的优选dsRNA或 siRNA分子，并在害虫食物中提供该分子。分离和纯化的核巧酸序列对可由cDNA文库和/ 或基因组文库信息提供。核巧酸序列对可来自任意优选的銷翅目害虫，用作热扩增引物W 产生用于制备本发明的dsRNA和siRNA分子的DNA模板。
[0124] 本发明提供核巧酸序列，其表达产生RNA序列，所述RNA序列与昆虫中的目标基因 的RNA分子实质上同源，所述昆虫包含由其基因组中的核巧酸序列编码的RNA序列。因此， 在消化稳定的RNA序列后，在昆虫细胞中可获得目标基因核巧酸序列的下调，其产生对昆 虫维持、生存、增殖、生殖和消化的有害作用。
[0125] 适于作为针对目标害虫的害虫防治试剂的分离的多核巧酸的实例如W下（a)-(d) 所示：
[0126]a)包含SEQIDNO: 1的核酸序列的多核巧酸；
[0127]b)与SEQIDNO: 1的核酸序列在严格条件下杂交的多核巧酸；
[0128]C)与SEQIDNO:1的核酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%序 列相同性的多核巧酸；
[0129]d)SEQIDNO: 1的核酸序列的至少16个连续核巧酸的片段；W及
[0130]e)序列（a)、化）、（c)或（d)的互补序列，
[0131] 其中半翅目作物植物害虫消化包含与所述多核巧酸或所述片段互补的至少一条 链的双链核糖核巧酸序列，W降低所述害虫的进食。
[0132] 本发明还提供SEQIDN0:1的核酸序列的片段或多联体（concatemer)。所述片段 可限定为表达为dsRNA并提供给害虫时，造成害虫的死亡、抑制、发育不良或停止进食。所 述片段可W例如包含SEQIDN0:1所示序列或其互补序列的至少约16、17、18、19、21、23、 25、40、60、80、100、125个或更多个连续核巧酸。用于本发明的一个有益的DNA片段至少长 约19至约23、或约23至约100个核巧酸，多达约2000或更多个核巧酸。特别有用的dsRNA 序列包括约23至约300个与害虫目标序列同源的核巧酸。本发明还提供由任意所述序列 表达的核糖核酸，包括dsRNA。选择用于基因抑制剂表达的序列可由来自一或多个目标害虫 的单个序列构建，并用于表达在所述一或多个目标害虫中抑制单个基因或基因家族的RNA， 或者所述DNA序列可由多个DNA序列构建为嵌合体。
[0133] 在其他实施方案中，本发明设及重组DNA构建体，其包含编码本文所述dsRNA分子 的核酸分子。dsRNA可通过来自核巧酸序列的dsRNA分子的一条链转录形成，所述核巧酸序 列与包含沈QIDNO: 1的核巧酸序列至少约80%至约100%相同。所述重组DNA构建体可 限定为被消化时，产生能够抑制害虫细胞内源目标基因表达的dsRNA分子。所述构建体可 包含与在宿主细胞中起作用的启动子序列可操作地连接的植物核巧酸序列。该启动子可W 是组织特异性的，并且可W例如特异于作为害虫攻击对象的组织类型。例如对于食根的昆 虫，希望使用提供根优选表达的启动子。
[0134] 本发明的核酸构建体可包含至少一种非天然存在的核巧酸序列，其可W转录成能 够通过杂交在体内形成dsRNA分子的单链RNA。该dsRNA序列自组装并能W銷翅类害虫的 食物提供，W实现期望的抑制。
[0135] 重组DNA构建体可包含两种不同的非天然存在的序列，当其在体内表达为dsRNA 序列，并W銷翅类害虫的食物提供时，其抑制銷翅类害虫细胞中至少两种不同的目标基因 的表达。在某些实施方案中，在细胞或包含具有害虫抑制效果的细胞的植物中产生至少3、 4、5、6、8或10个或更多个不同的dsRNA。dsRNA可由在不同转化事件中导入的多个构建体 表达，或者可单核酸分子导入。dsRNA可用单启动子或多启动子表达。在本发明的一个 实施方案中，产生单个dsRNA，其包含与害虫中的多个位点同源的核酸。在另一方面，本发明 提供在其基因组中具有至少一种重组DNA序列的重组宿主细胞，所述重组DNA序列经转录 产生至少一个dsRNA分子，当其被銷翅类害虫消化时，抑制害虫中目标基因的表达。dsRNA 分子可由本文所述W及序列表中所示的任意核酸编码。本发明还提供转化的植物细胞，在 其基因组中具有至少一种本文所述的重组DNA序列。还提供包含该转化的植物细胞的转基 因植物，包括任意代数的后代植物、种子化及植物产品，其均包含所述重组DNA。
[0136] 本发明提供能够在细胞或微生物中表达为RNA W抑制昆虫细胞、组织或器官中目 标基因表达的DNA序列。所述序列包含编码一或多种不同的核巧酸序列的DNA分子，其中 所述不同的核巧酸序列中的每一种均包含由间隔区序列连接的正义核巧酸序列和反义核 巧酸序列，其编码本发明的dsRNA分子。间隔区序列构成正义核巧酸序列或反义核巧酸序 列的部分，并形成于dsRNA分子中正义和反义序列之间。正义核巧酸序列或反义核巧酸序 列与目标基因或其衍生物或其互补序列的核巧酸序列实质上相同。dsDNA分子可W可操作 地置于启动子序列控制下，所述启动子序列在表达该dsDNA的宿主的细胞、组织或器官中 起作用，W产生dsDNA分子。在一个实施方案中，所述DNA序列可W来自SEQIDN0:1的核 巧酸序列。
[0137] 如上所述，本发明还提供在植物细胞中表达的DNA序列，当DNA表达为RNA并被 目标害虫消化时，其实现对昆虫害虫的细胞、组织或器官中目标基因的抑制。dsRNA至少包 含一或多种结构性基因序列，其中每种结构性基因序列包含由间隔区序列连接的正义核巧 酸序列和反义核巧酸序列，其在互补和反义序列中形成环。正义核巧酸序列或反义核巧酸 序列与目标基因、其衍生物或其互补序列的核巧酸序列实质上相同。一或多种结构性基因 序列可操作地置于一或多种启动子序列控制下，所述启动子的至少一种在真核或原核生物 体、特别是植物的细胞、组织或器官中是可操作的。
[013引本发明用于害虫防治的基因序列或片段可W克隆在两种组织特异性启动子之间， 例如两种根特异性启动子，其在转基因植物细胞中是可操作的，并在转基因植物细胞中表 达产生rnRNA，其在此形成dsRNA分子。植物组织中包含的dsRNA分子被昆虫消化，由此实 现对目标基因表达的期望的抑制。
[0139] 本发明提供的核巧酸序列可W包含由"间隔区序列"分隔的反向重复。所述间隔区 序列可W是包含任意核巧酸序列的区域，其有利于在每个重复之间形成二级结构，如果需 要的话。在本发明的一个实施方案中，所述间隔区序列是mRNA的正义或反义编码序列的部 分。所述间隔区序列可替代地包含核巧酸或其同系物的任意组合，所述核巧酸或其同系物 能够共价连接于核酸分子。所述间隔区序列可W包含长度至少约10-100个核巧酸，或可替 代地长度至少约100-200个核巧酸、长度至少约200-400个核巧酸、或长度至少约400-500 个核巧酸的核巧酸序列。
[0140] 序列表中的核酸分子或核酸分子片段或其他核酸分子能够与其他核酸分子在某 些条件下特异性杂交。用于本文，如果两种核酸分子能够形成反向平行、双链核酸结构，则 称两种核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两种核酸分子完全互补，则称一核酸分子是另 一核酸分子的互补序列。如果两种分子能够W足够的稳定性彼此杂交，W允许它们在至少 常规"低严格性"条件下保持彼此退火，则称两种分子"最低程度地互补"。类似地，如果 两种分子能够W足够的稳定性彼此杂交，W允许它们在常规"高严格性"条件下保持彼此 退火，则称两种分子是互补的。常规严格性条件在Sambrook,etal. (1989)和化ymeset al. (1985)中有记载。
[0141] 偏离完全互补是允许的，只要该偏离不会完全排除所述分子形成双链结构的能 力。因此，为了使核酸分子或核酸分子的片段作为引物或探针，其仅需要序列互补性足W能 够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
[0142] 促进DNA杂交的适当的严格条件是例如6.0X氯化钢/构祿酸钢（SSC)，约 45°C，之后用2. 0XSSC于50°C清洗，运是本领域技术人员已知的，或者可见于化rrent ProtocolsinMolecularBiology(1989)。例如，清洗步骤中的盐浓度可选自低严格的 50°C下的约2. 0XSSC，至高严格的50°C下的约0. 2XSSC。另外，清洗步骤中的溫度可从低 严格条件的室溫，约22°C，升至高严格条件的约65°C。溫度和盐均可变化，或者溫度或盐浓 度可保持恒定，而其他变量变化。用于本发明的核酸可特异性地与来自WCR或其互补序列 的一或多种核酸分子在该条件下杂交。优选地，用于本发明的核酸将显示与SEQIDN0:1 的核酸分子至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%、或甚至约100%的 序列相同性。
[0143] 本发明的核酸也可通过本领域已知的方法全部或部分合成，尤其是希望提供植物 优选序列时。因此，本发明的核酸的全部或部分可使用所选宿主优选的密码子合成。物种 优选的密码子例如可由在特定宿主物种中表达的蛋白中使用最频繁的密码子确定。核巧酸 序列的其他修饰可产生具有轻微改变的活性的突变体。dsRNA或siRNA核巧酸序列包含多 聚核糖核巧酸的双链，并且可包括憐酸-糖骨架或核巧的修饰。RNA结构的修饰可经调整 W允许特异性基因抑制。在一个实施方案中，dsRNA分子可通过酶促方法修饰，由此可产生 siRNA分子。所述siRNA可有效介导一些昆虫中的一些目标基因的下调效应。该酶促方法 可使用昆虫、脊椎动物、真菌或植物细胞中存在的真核RNAi通路中的RNAseIII酶或DICER 酶来实现巧化ashiretal, 2002;HamiltonandBaulcombe, 1999)。该方法也可使用通过 本领域技术人员熟知的重组DM技术导入目标昆虫细胞中的重组DICER或RNAseIII。昆 虫中天然存在的或由重组DNA技术制得的DIC邸酶和RNAseIII均将较大的dsRNA链切割 成较小的寡核巧酸。DICm?酶将dsRNA分子特异性切割成每个长约19-25个核巧酸的SiRNA 片段，而RNAseIII酶通常将dsRNA分子切割成12-15个碱基对的SiRNA。由两种酶的任 一种产生的SiRNA分子具有2-3个核巧酸的3'突出端，W及5'憐酸和3'径基末端。由 RNAseIII酶产生的siRNA分子与由真核RNAi通路中的Dicer酶产生的siRNA分子相同， 因此在其随后解链、分成单链RNA并与目标基因转录的RNA序列杂交后，其被内在的细胞 RNA降解机制祀向并降解。该方法导致昆虫中目标基因核巧酸序列编码的RNA序列的有效 降解或清除。结果是昆虫中被特定祀向的核巧酸序列的沉默。对酶促方法的详细描述可见 Harmon(2002)〇
[0144] 在一些实施方案中，本发明设及由本发明的多核巧酸表达产生的双链核糖核巧酸 序列，其中半翅目作物植物害虫消化作为RNAi诱导化合物的所述核糖核巧酸序列或其片 段，W减少所述害虫的进食。在有利的实施方案中，所述双链核糖核巧酸序列包含SEQID N0:2或其同系物的核酸序列，其中所述同系物与SEQIDN0:2具有至少80%、特别是至少 85%、特别是至少90%、特别是至少95%的序列相同性。
[0145]E.SHP抑制剂的渗入
[0146]SHP抑制剂的渗入方式不受特别限制，可根据目标害虫来选择。例如当所述目标害 虫是攻击植物的害虫时，含有SHP抑制剂的试剂（杀虫剂）通过施用、喷涂或喷雾预先留在 会被目标害虫攻击的植物中。由此，当目标害虫消化所述植物时，所述SHP抑制剂渗入目标 害虫体内。
[0147] 另一方面，当含有甜P抑制剂的食物（食物媒介物）放置在目标害虫出现或其进 入途径的位置时，目标害虫消化该食物，由此所述SHP抑制剂渗入目标害虫体内。另外，当 会被攻击的植物通过导入编码SHP抑制剂的基因修饰时，当害虫消化该转基因植物时，SHP 抑制剂渗入目标害虫体内。用于该方法的转基因植物可W是受到基因修饰的植物，由此表 达：(A)祀向编码目标害虫甜P的基因的SiRNA;度）祀向编码目标害虫甜P的基因的转录 产物的反义核酸；或（C)祀向编码目标害虫SHP的基因的转录产物的核酶。
[014引因此，在一些实施方案中，本发明的害虫防治方法包含制备会被目标害虫攻击的 植物，其具有含有通过预先施用、喷涂或喷雾的抑制剂的媒介物，并通过植物的消化将所述 抑制剂渗入目标害虫体内。
[0149] 然而，在一些有利的实施方案中，本发明的害虫防治方法包含通过消化含有编码 所述抑制剂的基因的转基因植物，将所述抑制剂渗入目标害虫体内。
[0150]E.载体和宿主细胞转化
[0151] 如上所述，本发明包含将本发明的核巧酸序列转化入植物中，W实现一或多种 dsRNA分子的害虫抑制水平的表达。可使用现有技术中提供的方法很容易地制备转化载体。 所述转化载体包含一或多种核巧酸序列，所述核巧酸序列能够转录成RNA分子，并与昆虫 基因组编码的一或多种核巧酸序列实质上同源和/或互补，由此当消化该RNA时，昆虫基因 组的至少一个相应核巧酸序列的表达下调。
[0152] 所述转化载体可命名为dsDNA构建体，并且还可定义为重组分子、昆虫防治试剂、 基因分子或嵌合基因构建体。本发明的嵌合基因构建体可包含例如编码一或多种反义转录 子、一或多种正义转录子、一或多种前述的每一种的核巧酸序列，其中由此产生的转录子的 全部或部分与RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含由昆虫基因组中的核巧酸序 列编码的RNA序列。
[0153] 在本发明的一个实施方案中，转化载体包含分离和纯化的DNA分子，所述DNA分子 包含与本发明的一或多种核巧酸序列可操作地连接的启动子。所述核巧酸序列例如是SEQ IDNO: 1或SEQIDNO: 2或其部分。所述核巧酸序列包括编码目标害虫RNA转录子中存在 的RNA的全部或部分的区段，并且可包含目标害虫RNA的全部或部分的反向重复。包含所 述表达载体的DNA分子也可包含定位于编码序列上游或甚至编码序列内的功能性内含子 序列，并且还可含有定位于启动子和翻译起始位点之间的5'非翻译前导序列（即UTR或 5' -UTR)。
[0154] 植物转化载体可包含来自多于一种基因的序列，由此允许产生抑制目标害虫细胞 中两种或更多种基因表达的多于一种dsRNA。本领域技术人员很容易理解，其序列对应存 在于不同基因中序列的DNA的区段可整合入单个复合DNA区段，用于在转基因植物中表达。 可替代地，已经含有至少一种DNA区段的本发明的质粒可通过在增强子、启动子W及终止 子序列之间顺序插入另外的DNA区段而修饰。在用于抑制多种基因的本发明的昆虫防治试 剂中，待抑制基因可获自相同的昆虫物种，W提高昆虫防治试剂的效力。在某些实施方案 中，所述基因可来自不同的昆虫，W拓宽所述试剂有效针对的昆虫的范围。当多种基因被祀 向性进行抑制或进行表达和抑制的组合时，多顺反子DNA元件可如Fillatti，公开号为US 2004-0029283的申请中示例和公开而构建。
[0155] 在不同植物物种中起作用的启动子也是本领域熟知的。用于植物中多肤表达的 启动子包括Odelletal. (1985)中所述的诱导型、病毒、合成或组成型启动子，和/或受 到时间调控、空间调控和时空调控的启动子。优选的启动子包括增强的CaMV35S启动子、 SUC2启动子和FMV35S启动子。为了本发明的目的，例如对通过其口针经初皮部进食的物 种进行最佳防治，优选在植物初皮部中实现运些基因最高水平的表达。因此，在一个有利 的实施方案中，所述启动子在作物植物的初皮部有活性，例如CaMV35S启动子灯angand Qiristou, 1990)和SUC2 启动子（TruermitandSauer, 1995)。Pitinoetal. (2011)使用 CaMV35S启动子控制dsRNA表达，其在晒虫中证实了宿主诱导的基因沉默化IG巧。
[0156] 在遗传修饰植物的初皮部定位表达针对SHP的目标特异性dsRNA或siRNA允许在 临界经济阔值之下最大可能地降低晒虫w及胸瞭亚目和蜡赠子亚目的其他吸食植物的昆 虫对作物植物的消化，运是IPS声称的目标。在运种情况下，覆盖SHPmRNA不同区域的不 同长度的dsRNA和SiRNA是可能的。
[0157] 本发明的重组DNA载体或构建体通常包含选择标记，其赋予植物细胞可选择的表 型。选择标记也可用于选择含有编码本发明的多肤或蛋白的外源核酸的植物或植物细胞。 所述标记可编码杀生物剂抗性、抗生素抗性（例如卡那霉素、G418博来霉素、潮霉素等）或 除草剂抗性（例如草甘憐等）。选择标记的实例包括但不限于：neo基因，其编码卡那霉素 抗性并能使用卡那霉素、G418等进行选择；bar基因，其编码双丙氨麟抗性；突变的EPSP合 酶基因，其编码草甘憐抗性；腊水解酶基因，其对漠苯腊有抗性；突变的乙酷乳酸合酶基因 (ALS)，其对咪挫嘟酬或横酷脈有抗性；W及抗氨甲蝶岭的DHFR基因。所述选择标记的实例 在美国专利 5, 550, 318、5, 633, 435、5, 780, 708 和 6, 118, 047 中例证。
[015引本发明的重组载体或构建体还可包括检测标记。检测标记可用于监测表达。示例 性的检测标记包括β-葡糖醒酸糖巧酶或uidA基因（GU巧，其编码各种显色底物已知的酶 (Jefferson, 1987Jeffersonetal，1987) ;R-基因座基因，其编码在植物组织中调控花青 素巧色素（红色）产生的产物值ellaportaetal, 1988) ;β-内酷胺酶基因（Sutcliffe etal，1978)，其编码各种显色底物已知的酶（例如PADAC，一种显色的头抱菌素）；蛋光素 酶基因（Owetal, 1986)，巧化基因狂址owskyetal, 1983)，其编码能转化显色儿茶酪的 儿茶酪双加氧酶；α-淀粉酶基因度ca化etal, 1990);酪氨酸酶基因（Katzetal, 1983)， 其编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多己酿的酶，所述多己酿随后凝结成黑素；α-半乳糖 巧酶，其催化显色的α-半乳糖底物。
[0159]在一些有利的实施方案中，本发明分离的多核巧酸与异源启动子可操作地连接， 和/或限定为包含在植物转化载体上。
[0160] 优选的植物转化载体包括来自根癌±壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)Ti质 粒的载体（例如美国专利4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501，967和6口 0 122 791)。 毛根±壤杆菌质粒（或"化"）也是有用的，并且是本领域已知的。其他优选的植物转化载 体包括例如Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和EP0120516 中公开的 那些。在一个有利的实施方案中，所述载体是二元载体化inaryvector)。
[016。 总体上，优选将功能性重组DNA导入植物基因组的非特异性位点。在特殊情况下， 通过位点特异性整合插入重组DNA构建体是有用的。存在几种已知具有植入功能的位点特 异性重组系统，包括美国专利4, 959, 317中公开的cre-loxW及美国专利5, 527, 695中公 开的FLP-FRT。
[0162] 适合用于当前植物的宿主细胞转化方法包括可将DNA导入细胞的几乎任意方 法，例如通过PEG介导的原生质体转化（Potrykusetal, 1985)、通过电穿孔（美国专 利 5,384,253)、通过用碳化娃纤维激发化aeppleretal，1990，美国专利 5,302,523，W 及美国专利5, 464, 765)、通过±壤杆菌介导的转化（美国专利5, 591，616和美国专利 5, 563, 055)W及通过DNA涂覆颗粒加速（美国专利5, 550, 318,美国专利5, 538, 877和美国 专利5, 538, 880)等直接递送DNA。通过应用如上技术，几乎任意种类的细胞均可被稳定转 化。对于多细胞物种，转基因细胞可再生成转基因生物体。产生转基因植物及在特定植物 中表达异源核酸的方法是已知的，并可使用本文提供的核酸制备转基因植物，所述转基因 植物表现出对目标害虫生物体，如作物食根昆虫的消化的降低的易感性。植物转化载体例 如可通过将产生本文公开的核酸的dsRNA插入植物转化载体，并将其导入植物而制备。一 种已知的载体系统来自于对根癌±壤杆菌的天然基因转移系统的改造。该天然系统包含大 Ti(肿瘤诱导）-质粒，所述质粒含有名为T-DNA的大区段，其被转移入转化植物中。Ti质 粒的另一个区段，vir区域负责T-DNA转移。T-DNA区域的边界是末端重复，在改造的二元 载体中，肿瘤诱导基因已缺失，vir区域的功能被用于转移外源DNA，所述外源D