由例如供给母 虫的营养较低，从而给了后代到达新宿主植物的机会而引起的。另外，运会导致原宿主植物 上晒虫群体的快速减少。鉴于shp沉默持续长达2周（图9B)，定居于新宿主植物会被打 乱。
[0259] 表3 :shp沉默对有翅后代比例的影响
[0260]
[0261]
[0262] 观察shp沉默对后代成熟时间的影响，其用于准备翅形成。表达shp-dsRNA的植 物品系的成熟时间显著更长（P<〇. 01 ;表4)。由于生殖开始的延迟，成熟时间增加对总的生 殖产生负面影响。另外，成熟时间增加提高了若虫成为捕食者猎物的风险，因为对小若虫而 言该风险高于成虫。
[0263] 表4 :shp沉默对后代成熟时间的影响。
[0264]
[026引实施例10:统计分析
[0266] 对顿虫行为的描述性统计分析用化igin8. 1G的riginLab公司，诺坦普顿 (No^hampton)，M，美国）进行，而处理结果的比较通过AN0VA和AN0VA级别，使用 SigmaPlotll(Systat软件公司，伦敦（Xondon),英国）进行DWald-Wolfowitz测试 (SigmaPlot11)用于分析非参数分类安排（class-arranged)行为数据。由于非参数数据 分析的样本量小，对Z和P值进行校正（SiegelS，1956)。生存分析用Kaplan-Meier生存 分析Log-Rank(SigmaPlot11)进行，AN0VA用于比较中位和最大生存率。生殖数据经AN0VA 分析。qRT-PCR数据、有翅顿虫比例分析W及成熟时间差异确定的数据经学生t-检验分析。 统计测试的显著水平设定为P二0. 05,而0. 05-0. 075的P值表明存在微小差异的趋势。
[0267] 参考文献
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【主权项】
1. 害虫防治方法，包括：将针对结构性鞘蛋白（SHP)的抑制剂掺入表达SHP的农业目 标害虫体内。2. 根据权利要求1的害虫防治方法，其中所述目标害虫是属于半翅目的昆虫。3. 根据权利要求2的害虫防治方法，其中所述目标害虫属于胸喙亚目和/或蜡蝉子亚 目。4. 根据权利要求3的害虫防治方法，其中所述目标害虫属于蚜虫属。5. 根据权利要求4的害虫防治方法，其中所述目标害虫是豌豆蚜。6. 根据权利要求1-5任一项的害虫防治方法，其中所述SHP由包含选自SEQIDNO: 1、 SEQIDN0:5和SEQID勵:7或其同系物的序列的1111?熟进行编码。7. 根据权利要求6的害虫防治方法，其中所述同系物与SEQIDNO: 1具有至少80%、 特别是至少85%、特别是至少90%的序列相同性，并且在目标害虫中编码功能性SHP。8. 根据权利要求1-7任一项的害虫防治方法，其中所述抑制剂是选自由以下（a) -(d) 组成的组的化合物： (a)RNAi诱导化合物，其靶向编码SHP的核酸或其部分； (b) 核酸构建体，其在细胞内产生靶向编码SHP的核酸或其部分的RNAi诱导化合物； (c) 反义核酸，其靶向编码目标害虫的SHP的基因的转录产物；以及 (d) 核酶，其靶向编码目标害虫的SHP的基因的转录产物。9. 根据权利要求8的害虫防治方法，其中所述RNAi诱导化合物是选自由以下组成的 组的化合物：短干扰核酸、siNA、短干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、短发卡RNA(shRNA) 及其前体，所述前体在细胞内会被加工形成实际的RNAi诱导化合物。10. 根据权利要求9的害虫防治方法，其中所述前体是双链RNA(dsRNA)。11. 根据权利要求10的害虫防治方法，其中所述dsRNA包含SEQIDNO: 2或其同系物 所示序列。12. 根据权利要求11的害虫防治方法，其中所述同系物与SEQIDN0:2具有至少80%、 特别是至少85%、特别是至少90%的序列相同性。13. 根据权利要求1-12任一项的害虫防治方法，包括：通过预先施用、喷涂或喷雾而使 将要被目标害虫攻击的植物具有含有抑制剂的试剂，以及通过所述植物的消化将所述抑制 剂掺入目标害虫体内。14. 根据权利要求1-13任一项的害虫防治方法，包括：通过含有编码所述抑制剂的基 因的转基因植物的消化，将所述抑制剂掺入目标害虫体内。15. 分离的多核苷酸，其选自： a) 包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:5和SEQIDN0:7的核酸序列的多核苷酸； b) 与选自SEQIDNO: 1、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7的核酸序列在严格条件下杂交 的多核苷酸； c) 与选自SEQIDN0:l、SEQIDN0:5和SEQIDN0:7的核酸序列具有至少70%、至少 80 %、至少85 %、至少90 %序列相同性的多核苷酸； d) 选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:5和SEQIDN0:7的核酸序列的至少16个连续核苷 酸的片段；以及 e) 序列（a)、（b)、（c)或⑷的互补序列， 其中半翅目作物、温室和/或观赏植物的害虫消化包含与所述多核苷酸或所述片段互 补的至少一条链的双链核糖核苷酸序列，以降低所述害虫的进食。16. 根据权利要求15的分离的多核苷酸， (i) 其限定为与异源启动子可操作地连接；或者 (ii) 其限定为包含在植物转化载体上。17. 根据权利要求16的分离的多核苷酸，其中所述启动子在作物植物的韧皮部有活 性。18. 根据权利要求17的分离的多核苷酸，其中所述启动子是CaMV35S或SUC2启动子。19. 根据权利要求16-18任一项的分离的多核苷酸，其中所述载体是二元载体。20. 由权利要求15-19任一项的多核苷酸的表达产生的双链核糖核苷酸序列，其中半 翅目作物、温室和/或观赏植物的害虫对所述核糖核苷酸序列的消化，会降低所述害虫的 进食。21. 根据权利要求20的双链核糖核苷酸序列，其中所述核糖核苷酸序列包含SEQID NO:2的核酸序列。22. 用权利要求15-19任一项的多核苷酸转化、转导或转染的细胞。23. 根据权利要求22的细胞，限定为 (i) 原核细胞；或者 (ii) 真核细胞；或者 (iii) 植物细胞。24. 用权利要求15-19任一项的多核苷酸转化、转导或转染的植物，或其包含所述多核 苷酸的种子。25. 根据权利要求24的植物，其中所述多核苷酸在植物细胞中被表达为双链核糖核苷 酸序列；并且，在食物中的所述双链核糖核苷酸序列和/或来自所述双链核糖核苷酸序列 的RNAi诱导化合物的目标害虫抑制量的消化，会抑制目标害虫进一步进食所述食物，优选 地 (i) 所述目标害虫是属于半翅目的昆虫，特别是属于胸喙亚目和/或蜡蝉子亚目的昆 虫，特别是属于蚜虫属的害虫，特别是豌豆蚜；或者 (ii) 所述双链核糖核苷酸序列或其片段的目标害虫抑制量的消化，会阻碍所述害虫的 生长。26. 由权利要求24-25任一项的植物产生的商品产品，其中所述商品产品包含可检测 量的权利要求16-20任一项的多核苷酸或由其表达的核糖核苷酸。27. 控制半翅目害虫侵扰的方法，包括： 在半翅目害虫的食物中提供包含第一多核苷酸序列的试剂，其在被害虫消化时会起作 用，以抑制所述害虫中的生物学功能， 其中所述多核苷酸序列与来自所述害虫的SHP编码序列在至少约16至约25个连续核 苷酸上显示约95%至约100%的核苷酸序列相同性，并与和所述第一多核苷酸序列互补的 第二多核苷酸序列杂交，并且 其中来自所述害虫的所述SHP编码序列选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:5和SEQIDN0:7 或其互补序列。28.根据权利要求27的方法，其中所述半翅目害虫是属于胸喙亚目的昆虫，其优选选 自蚜虫属和粉虱属。29.根据权利要求27的方法，其中所述半翅目害虫是属于蜡蝉子亚目的昆虫。30.根据权利要求27的方法，其中所述半翅目害虫是豌豆蚜。31.控制半翅目害虫侵扰的方法，包括：在半翅目害虫的食物中提供表达权利要求 16-20任一项的多核苷酸序列的植物细胞， 其中所述多核苷酸的表达会产生双链核糖核酸， 其中所述双链核糖核酸和/或来自所述双链核糖核酸的RNAi诱导化合物在被所述害 虫消化时会抑制SHP编码目标序列在所述害虫中的表达，并导致对所述食物的进食相对于 缺少所述植物细胞的食物的减少。32.权利要求31的方法，其中 a)所述害虫在消化所述细胞或其内含物之后表现为生长变慢；或者 b) 所述半翅目害虫是属于胸喙亚目的昆虫，其优选选自蚜虫属和粉虱属；或者 c)所述半翅目害虫是属于蜡蝉子亚目的昆虫；或者 d) 所述半翅目害虫是豌豆蚜；或者 e)所述多核苷酸在被害虫消化时起作用，以抑制执行昆虫生存必需功能的基因，所述 功能选自鞘硬化、害虫进食、营养去除以及生殖的能力或欲望。33.对受到昆虫害虫侵扰的作物植物所产生的作物产量进行改善的方法，所述方法包 含以下步骤： a)将权利要求15-19任一项的多核苷酸导入所述作物植物， b) 培养所述作物植物，以使所述多核苷酸表达，其中所述多核苷酸的表达会抑制昆虫 害虫的进食以及由于害虫侵扰而导致的产量损失。34.转基因植物，其包含对目标害虫的SHP的抑制剂进行编码的基因。35.根据权利要求34的转基因植物，其中所述基因是根据权利要求15-19任一项的多 核苷酸。36.权利要求15-19任一项的多核苷酸作为昆虫防治试剂的用途。
【专利摘要】本发明提供的技术涉及通过将针对结构性鞘蛋白(SHP)的抑制剂掺入农业目标害虫体内的多种类害虫防治的方法，以及用于所述方法的害虫防治试剂，以及转基因作物、温室和观赏植物。
【IPC分类】C12N15/82, A01N61/00, C07K14/435
【公开号】CN105339385
【申请号】CN201480021264
【发明人】托尔斯滕·威尔, 安德烈亚斯·维尔辛斯卡斯, 瑞纳尔·费希尔
【申请人】弗劳恩霍夫应用研究促进协会, 吉森大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年5月28日
【公告号】CA2914275A1, EP2810952A1, EP3004148A1, US20160135466, WO2014195209A1