Tris27. 23g
[0081]SDS0. 4g
[0082] 超纯水定容至150mL，用盐酸调pH8. 8,4°C保存
[0083] (8)浓缩胶缓冲液
[0084] Tris 6g
[0085]SDS0. 4g
[0086] 超纯水定容至100mL，用盐酸调pH6. 8,4°C保存
[0087] (9) 50XTAE：
[0088]冰乙酸 57. lmL
[0089] 0. 5mol/L EDTA(pH 8. 0) lOOmL
[0090] Tris 242g
[0091] 纯水定容至1000mL，4°C保存
[0092] (10)考马斯亮蓝R250染色法
[0093] 溶液一：50%乙醇、10%乙酸
[0094] 溶液二：5%乙醇、7. 5%乙酸
[0095] 溶液三：0· 25 %R250的95 %乙醇溶液
[0096] 注：50mL溶液二加入200μL溶液三
[0097]1. 7主要仪器设备
[0098] 摇床D250,美国NBS公司产品；
[0099] 恒温培养箱DHP120,上海实验仪器总厂；
[0100]Beckman高速离心机AvantiJ_26xp;
[0101]德国台式Eppenddorf离心机 5415C;
[0102] PCR仪：Thermocycler，Biometra公司
[0103] 核酸电泳仪：DYY-5型，北京六一厂；
[0104]凝胶成像系统UniversalHoodII，BI0-RAD公司；
[0105]蛋白电泳仪：MiniproteinIII，BI0-RAD公司；
[0106] 转膜仪：eBlot快速转膜仪，南京金斯瑞公司
[0107] 高效液相色谱系统：AKTAavant，GE公司
[0108] 荧光信号监测系统：Typhoon扫描仪，GE公司
[0109] 2.实验方法
[0110] 2.lCrylAh蛋白的提取及活化
[0111] (1)挑取单菌落于5mLLB培养基中（加5yL红霉素），30°C230rpm12h;
[0112] (2)按1 %的接菌量转接到1L三角瓶中（每瓶盛有400mL1/2LB液体培养基，并 加入400μL红霉素），30°C，230rpm，培养至90%以上的晶体释放，停止培养；
[0113] (3)将发酵液 4°C8000rpm离心 10min，沉淀用预冷的 1. 0mol/LNaCl(50mL/l升菌 液）洗涤，重复一次；
[0114] (4)4°C8000rpm离心lOmin后，用预冷的无菌水洗涤一次（50mL/l升菌液）；
[0115] (5)收集沉淀，悬于50mMNa2C03溶液中并加入胰蛋白酶，37°C，230rpm处理2h，溶 解与活化同时进行；
[0116] (6)4°C14000rpm离心 20min，取上清，加入1/7体积的4.Omol/LNaAc-HAc (pH 4·5)，调pH 4·5-5.0 ;
[0117] (7) 4°C静止4h(或冰上沉淀l_4h);
[0118] (8) 4°C14000rpm离心 15min，沉淀用无菌水洗悬浮后，4°C14000rpm离心 15min， 重复一次，最后收集沉淀，并溶于50mMNa2C03中，搅拌至完全溶解。
[0119] (9)SDS-PAGE检测Cry蛋白的提取结果，并BSA标准品进行定量。
[0120] 2. 2生物标记CrylAh蛋白
[0121] 称取lmgBiotinN-hydroxysuccinimideester溶于lmL二甲基亚楓（DMS0)中， 配制成lmg/mL母液于-20°C保存，向待标记蛋白溶液中加入30倍摩尔量的生物素溶液，室 温静置lh，置于脱盐柱中离心除去过量的生物素。Westernblot杂交检测标记效果。
[0122] 2.3Ligandblot鉴定ΑΡΝΙ受体结合区
[0123] (1)蛋白样品先进行SDS-PAGE分析，再转至PVDF膜上；
[0124] (2)PVDF膜在PBS缓冲液中漂洗3次，每次lOmin ;
[0125] (3)卩￥0卩膜在4〇11^?85+2%了￥6611中封闭2〇11^11，再以？85-1'(0.1%了￥6611)漂洗 3次，每次lOmin;
[0126] (4)在4mLPBS-T中加入8μg生物素标记的CrylAh蛋白，PVDF膜室温孵育lh，
[0127] (5)再以PBS-T漂洗 3 次，每次lOmin;
[0128] (6)以1:10000的比例在PBS-T中加入带有荧光标签的链霉亲和素，室温孵育lh，
[0129] (7)以PBS-T漂洗lOmin，再以PBS漂洗 2 次，每次lOmin;
[0130](8) PVDF膜瞭干，以Typhoon扫描仪分析结果。
[0131] (9)竞争结合：在结合时，以1:1000的摩尔比加入合成的多肽。
[0132] 2. 4序列分析软件
[0133]DNAMAN用来分析比较核苷酸或蛋白序列；
[0134]PyMOL软件用来分析预测的Cry蛋白的三维结构。
[0135] 2. 5 反向PCR
[0136] 反向PCR原理示意图如下（图1)，根据原基因序列在受体结合区以外分别设计正 向和反向引物，然后将拟插入的连续多点突变序列一分为二，分别加在正向引物和反向引 物的5'端，从基因内部反向扩增，扩增得到的片段含有完整的载体，以及断开的插入序列， 因此用磷酸化酶处理后，可以进行自连，形成闭合完整的质粒。
[0137] (1)反向PCR反应体系如下：
[0138] 模板 ：1pL
[0139]
[0140] (2)扩增条件如下：
[0141]
[0142] 2. 6磷酸化处理（BKL试剂盒）：
[0143] (1)反应体系：
[0144]
[0145] (2)反应条件：
[0146] 37°C处理lOmin，70°C处理5min ;
[0147] 2. 7连接反应
[0148] 取5 μ L上述反应产物加5 μ L SI，16°C连接3h。
[0149] 2. 8TG1和Rosetta(DE3)感受态细胞制备及转化
[0150] (1)将甘油菌在固体LB培养基上进行活化，37°C培养10小时后，再进行划线培养， 37°C培养12小时后，挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，37°C，220rpm震荡培养12小时， 再按1%接菌量转入lOOmL液体LB培养基中扩大培养（500mL三角瓶），37°C，220rpm培养， 培养至〇D6。。约为0. 5。
[0151] (2)将菌液转移至2个无菌预冷的50mL离心管中，冰上放置lOmin，使培养物冷却 到(TC;
[0152] (3)4。(：，4100印111离心1〇11^11;
[0153] (4)倒出培养液，将管倒置lmin，使最后痕量的培养液流尽；
[0154] (5)每 50mL初始培养液用 30mL预冷的 0·lmol/LCaC12-MgC12 (20mMCaC12-80mM MgC12)重悬每份细胞；
[0155](6)4°C，4100rpm离心lOmin ;
[0156] (7)每50mL初始培养物用2mL冰预冷的0·lmol/LCaC12重悬，再加入等体积甘 油，分装200μL/管，-70 °C保存。
[0157] 将200μL感受态细胞与10μL连接产物或2μL质粒混勾，冰浴30min，42°C热击 1. 5min，冰浴3min，加入600μLLB培养基37°C培养lh，涂布含含相应抗生素的LB的平板， 37 °C培养过夜。
[0158] 2. 9阳性克隆的PCR鉴定
[0159] 挑取单克隆于5mLLB液体培养基震荡培养，37°C，220rpm，震荡培养6h，取1yL作 为模版，进行PCR鉴定，PCR鉴定体系和反应条件如下：
[0160] (l)PCR体系：
[0161]
[0162] (2)反应条件：
[0163]
[0164]PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0165] 2. 10序列测定及分析
[0166] 每个截短片段选取TG1中两个阳性克隆送往农科院测序部进行全长测序，DNAMAN 软件分析测序结果正确后，提取TG1中质粒，并转入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行表达。
[0167] 2. 11大肠杆菌中蛋白诱导表达
[0168] (1)LB平板（AC抗性）上活化过夜，挑单菌落转接于5mL液体LB培养基（AC抗性） 中，37°C，220rpm培养12h后，将5mL培养液全部转入300mL液体LB培养基（AC抗性）中， 培养约3h，0D6。。达到0· 5,加入IPTG终浓度为0· 5mM，18°C，150rpm，培养过夜12h。
[0169] (2)8000rpm离心lOmin收集菌体，沉淀溶于 30mL20mMTris-HClpH8. 0 的缓 冲液中，进行超声破碎（冰浴），功率65%，时间5min，超3s停5s。超声后lOOOOrpm离心 20min，收集上清，沉淀用少量20mMTris-HClpH8.0重悬。
[0170] (3)SDS-PAGE分析蛋白表达情况：
[0171] (4)制样：上清，20 μ L样品+5 μ L 5 X Loading Buffer
[0172] (5)沉淀，5yL样品+15yL 20mM Tris-HCl pH 8.0+5yL 5XLoading Buffer
[0173] (6)煮沸 10min，12000rpm离心 5min上样 5μ L。
[0174] (7)电泳条件：120V预电泳15min，80V浓缩胶，200V分离胶（冰浴）
[0175] (8)染色：50mLSI微波加热 30s，摇床上 70rpm5min，换 50mLSII+200yL考 马斯亮蓝染液SIII，微微波加热30s，摇床上70rpm30min，换蒸馏水，摇床70rpm。
[0176] 2. 12棉铃虫生物活性测定
[0177] (1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3. OmL待测样品溶液，用药匙充分搅 拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
[0178] (2)将全部饲料分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中；
[0179] (3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉 丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于24孔板中，每孔一头；接完后，在24孔板上盖一层吹塑 纸，再盖盖子，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸；
[0180] (4)放置25°C光照培养箱中培养，光周期为12 :12。第一天时，培养箱中不需要额 外添加水盆，从第二天起，湿度〈30%时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检