查光照、 湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
[0181] (5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC5。。
[0182] 2. 13亚洲玉米螟生物活性测定
[0183] (1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3. OmL待测样品溶液，用药匙充分搅 拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
[0184] (2)将全部饲料分装于3个一次性灭菌培养皿中；
[0185] (3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉 丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于饲料上，每皿30头；接完后，将盖子盖好，并用橡皮筋 固定，严格密封，防止幼虫逃逸；
[0186] (4)放置25°C光照培养箱中培养。第一天时，培养箱中不需要额外添加水盆，从第 二天起，湿度〈30%时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲 料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
[0187] (5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC5。。
[0188] 2. 14水稻二化螟生物活性测定
[0189](1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3. OmL待测样品溶液，用药匙充分搅 拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
[0190] (2)将全部饲料分装于3个已消毒的一次性培养皿中；
[0191] (3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉 丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于饲料上，每皿30头；接完后，再盖盖子，并用橡皮筋固 定，严格密封，防止幼虫逃逸；
[0192] (4)放置25°C光照培养箱中培养。第一天时，培养箱中不需要额外添加水盆，从第 二天起，湿度〈30%时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲 料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
[0193] (5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC5。。
[0194] 3结果与分析
[0195] 3.lCrylAh蛋白的生物素标记
[0196] 如图2所示，westernblot可以检测到60kDa的条带，说明，CrylAh已被标记。
[0197] 3. 2CrylAh和CrylAi蛋白三维结构及氨基酸序列的比较
[0198] 在分析棉铃虫ΑΡΝΙ的结构基础上，将其分为4个区域进行表达，分别为H1 (33-257 位氨基酸）、Η2 (258-547位氨基酸）、Η3 (548-798位氨基酸）和Η4 (799-1014位氨基酸）， 并将其连在pET28a表达载体上，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达，SDS-PAGE检测结果 表明：4个片段均可在大肠杆菌中表达（图3);Ligandblot结果表明：片段H3 (548-798) 可以与CrylAh蛋白结合，其余片段不与CrylAh蛋白结合（图4)。
[0199] 3. 3受体结合区域的鉴定
[0200] 大量研究表明：Cry蛋白DomainII上的loop区域与受体结合有关。在分析预测 CrylAh蛋白三维立体结构的基础上，确定其DomainII的4个loop区域，并合成相应的短 肽，多肽序列见表3。首先以生物素标记的CrylAh蛋白进行与棉铃虫ΑΡΝΙ饱和结合分析， 结果如图5Α所示，选取在结合体系中加入2. 0μg的Bl°tinCrylAh蛋白，接近饱和结合的浓度 进行后续的竞争结合实验；竞争结合实验结果表明：1〇〇Ρα-8和loop1不能竞争CrylAh 与片段H3的结合，loop2和loop3能减弱CrylAh蛋白与片段H3的结合，但不能完全竞 争（图5B)。而loop2和loop3同时存在时，可以竞争CrylAh蛋白与片段H3的结合（图 5C) 〇
[0201] 3. 4CrylAh和CrylAi蛋白三维结构及氨基酸序列的比较
[0202] 将CrylAh蛋白和CrylAi蛋白的氨基酸序列提交SWISS-MODELworkspace进行三 维结构的预测，并用PyMOL软件分析预测的三维结构，根据序列比对和结构分析，首先确定 了CrylAh蛋白和CrylAi蛋白的三个Domain相应的位置及DomainII中loop区域对应的 氨基酸序列（见图6)。
[0203] 3. 5连续多点突变体的构建与表达
[0204] 明确了CrylAh蛋白与棉铃虫ΑΡΝΙ片段H3的结合区域是loop2和loop3的基础 上，在比对分析CrylAh蛋白和CrylAi蛋白DomainII中4个loop的差异后，拟将CrylAi 蛋白的1〇〇ρ2和loop3进行连续多点氨基酸突变，增强其与受体的结合能力，以提高杀虫 毒力。以pEB-crylAi质粒为模板，用Primerstar高保真酶进行反向PCR扩增，扩增引物 序列见表2。反向PCR是从插入区域向载体方向扩增目的片段和载体，扩增引物上包含插入 区域的碱基序列。电泳检测PCR扩增结果如图7所示，均能扩增出llkb左右的目的条带。
[0205] 3. 6阳性克隆的鉴定
[0206]挑取TG1中阳性克隆进行PCR鉴定（PEBF和PEBR为引物），电泳检测PCR鉴定结 果如图8所示，大部分阳性克隆均含有目的片段，说明连续多点突变体构建成功。
[0207] 提取各突变体在TG1中的质粒，转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，阳性克隆进行 PCR鉴定，电泳分析PCR鉴定结果如图9所示。
[0208] 3. 7突变体的表达分析
[0209] 突变体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，进行IPTG诱导表达，并利用超 声波破碎法提取目的蛋白，最后以SDS-PAGE分别检测可溶性蛋白和包涵体蛋白。结果表 明：连续多点突变体均能在大肠杆菌中正常表达（图10)。
[0210] 3. 8棉铃虫生物活性分析
[0211] 首先将连续多点突变体蛋白进行定量，梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加 入到30g人工饲料中，混匀备用。7天分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。随着 CrylAi蛋白浓度由1μg/g升高到243μg/g，棉铃虫的校正死亡率并没有呈现出明显上 升的趋势，而是维持在40%左右；连续多点突变体ModCrylAi-loop3对棉铃虫的作用与 对照相似，校正死亡率为0%。而连续多点突变体ModCrylAi-loop2不同，随着浓度的升 高，棉铃虫的校正死亡率也逐渐升高。利用SPSS17.0软件分析各各蛋白的致死中浓度 (LC5。)，结果显示（表4)，CrylAi蛋白对棉铃虫的致死中浓度>500μg/g，而连续多点突变 体ModCrylAi-loop2对棉铃虫的致死中浓度为44. 90yg/g，至少提高了 13倍。
[0212] 3. 9亚洲玉米螟生物活性分析
[0213] 以梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加入到30g人工饲料中，混匀备用。7 天分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。利用SPSS17.0软件分析各蛋白的致 死中浓度（LC5。)，结果显示（表4)，CrylAi蛋白的活性为9.07yg/g，连续多点突变体 ModCrylAi-loop2的活性为1. 09μg/g，比改造前的CrylAi蛋白提高了近9倍。
[0214] 3. 10棉铃虫生物活性分析
[0215] 以梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加入到30g人工饲料中，混匀备用。7天 分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。利用SPSS17.0软件分析各各蛋白的致死中 浓度（LC5。)，结果显示（表4)，CrylAi蛋白对水稻二化螟的活性为15. 31μg/g，连续多点突 变体ModCrylAi-loop2和连续多点突变体ModCrylAi-loop3对水稻二化螟的活性分别为 3. 97μg/g和2. 52μg/g，比改造前的CrylAi蛋白提高5-6倍左右。
[0216] 表4连续多点突变体对几种鳞翅目害虫的致死中浓度
[0217]
[0218] 4 结论
[0219] 5. 1棉铃虫ΑΡΝΙ片段H3 (548-798位氨基酸）与CrylAh蛋白结合
[0220] 5.lCrylAh蛋白上DomainII的loop2 (RPFNIGINNQQ)和loop 3(SMFRSGSSSSVSIIR)是受体结合区域；
[0221] 5. 2CrylAh蛋白上DomainII其中loop2 (RPFNIGINNQQ)决定其对棉铃虫的杀虫 特异性；
[0222] 5. 3本发明采用10个以上的氨基酸连续多点突变DomainII中的loop2或loop 3,可以得到高活性的Cry蛋白突变体。
[0223] 5. 4连续多点突变体ModCrylAid-loop2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连 续多点突变体ModCrylAi-loop2对玉米螟的活性比改造前的CrylAi蛋白提高了近9倍； 连续多点突变体ModCrylAi-loop2和连续多点突变体ModCrylAi-loop3对水稻二化螟的 活性比改造前的CrylAi蛋白提高5倍-6倍左右。
【主权项】
1. 获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白立体结构DomainII的loop2或/ 和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10以上的氨基酸 序列的改变。2. 根据权利要求1所述的方法，所述Cry蛋白为CrylAi或CrylAh蛋白。3. 根据权利要求2所述的方法，所述突变为CrylAi蛋白loop2或/和loop3中氨基 酸序列突变。4. 根据权利要求3所述的方法，所述突变为CrylAi突变体蛋白loop2中的 369RPFNIGINNQQ379序列突变，或 / 和CrylAi突变体蛋白loop3 中的 435SMFRSGSSSSVSIIR449 序列突变。5. 权利要求1-4任一方法得到的蛋白突变体。6. 根据权利要求5所述蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQIDN0:2或SEQIDN0:4所 不。7. 编码权利要求6所述的蛋白突变体的基因。8. 根据权利要求7所述基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1或SEQIDNO:3所示。
【专利摘要】本发明涉及获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体，属于生物技术领域。获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白DomainⅡ的loop2或/和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10以上的氨基酸序列的改变。本发明连续多点突变体ModCry1Aid-loop？2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop？2对玉米螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop？2和连续多点突变体ModCry1Ai-loop？3对水稻二化螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高5倍-6倍左右。
【IPC分类】C12N15/32, C07K14/325
【公开号】CN105348374
【申请号】CN201510864727
【发明人】周子珊, 张 杰, 束长龙, 耿丽丽, 宋福平, 梁革梅, 彭琦
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月1日