耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌CGMCC No.10669及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及巨大芽孢杆菌新的菌株以及该菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 生物基化学品是指利用可再生的生物质（淀粉、葡萄糖、木质纤维素等）为原料生 产的大宗化学品和精细化学品等产品。生物基化学品的研发可以摆脱了对不可再生的原料 (石油、煤和天然气等）的依赖，避免或减少了温室气体的排放，被认为是实现可持续发展 的重要方向，已引起世界各国的广泛重视。美国2012年发布的"国家生物经济蓝图"将发 展生物基化学品作为生物经济的主要内容之一。生物基化学品也被我国政府作为生物制造 业的产业的核心内容。
[0003] 目前已经有大量的生物基化学品被利用微生物生产出来，包括2, 5-呋喃二甲酸、 天冬氨酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、山梨醇、3-羟基-γ - 丁内酯等。这些化学品的生产 宿主菌大部分为工程菌如大肠杆菌、酵母菌等。随着测序技术和代谢工程技术的不断发展， 越来越多的野生菌株被开发出来，通过改造应用于生物基化学品的生产。此外，葡萄糖的耐 受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高 浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。因此， 发掘具有葡萄糖耐受性的生产生物基化学品的菌株具有重要的意义。因此，本发明的目的 是，提供一种新的耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌新的菌株以及利用该菌株生产1-羟 基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明着眼于开发更多的可用于代谢工程改造生产生物基化学品的野生菌株， 特别是工业菌株的高浓度葡萄糖耐受性需要提升的现状，筛选获得高浓度葡萄糖耐受性的 巨大芽孢杆菌（Bicillus megaterium.)，以及利用该菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、 丙烯酸、丁烯酸等化学品的方法。
[0005] 本发明提供了一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌（Bicillus megaterium.)， 其保藏编号为=CGMCC No. 10669,保藏日期为2015年3月30日。
[0006] 所述耐受高葡萄糖浓度的巨大芽孢杆菌（Bicillus megaterium.)是从云南省临 沧市烟草试验站烟田土壤中采样，通过高浓度葡萄糖选择性培养基分离得到的。
[0007] 所述CGMCC No. 10669的巨大芽孢杆菌具有如下生物学特征：
[0008] 单个细胞0.7~0.8X2~3μπι，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳 性菌，芽孢0. 6~0. 9 X I. 0~1. 5 μ m，椭圆到柱状，位于菌体中央稍偏，芽孢形成后菌体不 膨大。菌落表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
[0009] 上述巨大芽孢杆菌菌株的经通用引物PCR获得16S rDNA序列与其它多株巨大芽 孢杆菌的16S rDNA序列有99%的相似性但是不同。
[0010] 其中上述 PCR 的引物为 fDl :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，
[0011] rP2 ：CGGCTACCTTGTTACGACTT〇
[0012] 进一步的，本发明还公开了 CGMCC No. 10669的巨大芽孢杆菌的应用方法，即：利 用保藏编号为：CGMCC No. 10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟 基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸。
[0013] 所述巨大芽孢杆菌能够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产生1-羟 基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸，具体为：
[0014] 所述巨大芽孢杆菌筛选培养基配方为：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏2~10g/l， NaCl 3~6g/l，葡萄糖300~500g/L，pH值7. 0~7. 4,最佳温度为30~37°C，
[0015] 培养时的转速为100~140r/min，
[0016] 生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的所述巨大芽孢杆菌菌株培养在 250ml的三角瓶中，装液量为40~80ml，
[0017] 生产1-羟基-2- 丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养时间为36~48小时，
[0018] 生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养基的灭菌条件为110~ 120 °C灭菌20~30分钟。
[0019] 进一步的，按照所述巨大芽孢杆菌能够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产 生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的操作方法：
[0020] 该巨大芽孢杆菌能够在含有500g/L的葡萄糖的培养基中生长，在摇瓶发酵水平 上能够产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，具有极高的开发价值。
[0021] 进一步的，利用该巨大芽孢杆菌菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁 烯酸时的复合氮源还可以为：
[0022] 酵母浸出物+蛋白胨（1 : 1)、酵母浸出物+蛋白胨+氯化铵（2 : 2 : 1)或者酵 母浸出物+蛋白胨+尿素（2 : 2 : 1)
[0023] 碳源还可以为：
[0024] 甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖
[0025] 即、耐受高浓度葡萄糖的的生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的复 合氮源可以是牛肉膏或蛋白胨，但不局限于牛肉膏和蛋白胨，碳源为葡萄糖，但不仅限于葡 萄糖。
[0026] 本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC No-10669是一种分离的全新的菌株，该菌株具高浓 度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包括1-羟 基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产相应的 化学品奠定基础。葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄 糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产 物的浓度具有重要意义。
[0027] 保藏信息：
[0028] 菌株名称：巨大芽抱杆菌（Bicillus megaterium.)
[0029] 参据的生物材料（株）：CAS5077-67-8-YNLC
[0030] 保藏日期：2015年3月30日
[0031] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)
[0032] 保藏编号：CGMCC No. 10669
[0033] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0034] 图1巨大芽孢杆菌的高浓度葡萄糖耐受性
[0035] 图2摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产化学品的质谱图（a. 1-羟基-2- 丁酮、b.当归内 酯、c.丙烯酸、d. 丁烯酸
【具体实施方式】
[0036] 一 ：菌株筛选
[0037] 1.培养基及培养条件：
[0038] 耐受高浓度葡萄糖产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯酸等化学品的菌 株的筛选配方为：胰蛋白胨3~8g/l，牛肉膏2~5g/l，NaCl 3~5g/l，MgSO4 · 7H20,2~ 48/1，葡萄糖300~50(^/1，？!1值7.0~7.4。最佳温度为30~37°(：，转速为100~14(^/ min，在250ml的三角瓶中的装液量为40~80ml。
[0039] 培养时间为24~36小时。
[0040] 上述烟培养基的灭菌条件为IKTC~115°C灭菌20~30分钟。
[0041] 上述培养基中添加1 %~1. 5%的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。2.筛选 方法：
[0042] 取污水、污泥以及腐败生物质的土壤按照0. 8~I. 2g样品4~7ml水溶解，将水 样置于室温20~39小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取Iml加入另一盛有9ml无菌 水的试管中，混合均匀，以此类推制成10 1UO 2、10 3、10 4、10 5、10 6不同稀释度的土壤。
[0043] 取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到以添加1%~1. 5%的琼脂的含有高浓度葡萄 糖的培养基制成的固体培养基培养皿上。
[0044] 上述菌落的产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯酸等化学品的菌株的筛 选方法为：将上述稀释液体100~300 μ 1，涂布于含有300~500g/L高浓度葡萄糖的平板 上，24~48小时后获得少量菌株。
[0045] 上述筛选获得菌株，利用50ml的摇瓶，培养24~36小时后挑取单菌落进行液体 培养，葡萄糖耐受性试验。经筛选共获得菌株5株，进行摇瓶培养后利用气相-质谱鉴定产 生的化学品。
[0046] 二：葡萄糖耐受性的验证
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