耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No.10671及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及葡萄球菌的新的菌株以及该菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 乙偶姻和2, 3- 丁二醇是两种重要的化学品，在乙偶姻还原酶的还原作用下，乙偶 姻可以被还原为2,3_ 丁二醇。该两种化合物常常被细菌联产。乙偶姻是一种广泛使用的食 用香料，也可以被应用到其它很多行业，但是目前市场上的乙偶姻大部分是由化学合成法 生产的，不符合食品安全的需要，同时该方法对环境也有较大的污染。为了满足食品安全、 环境保护和可持续发展的需要，微生物法发酵生产乙偶姻的水平需要得到进一步的提高。 2, 3- 丁二醇是一种重要的生物燃料，由于微生物能够较好的耐受2, 3- 丁二醇，因此该燃料 受到科研工作者的高度重视。开发能够生产乙偶姻和2, 3-丁二醇的高效菌株具有较高的 理论研究和应用价值。
[0003] 在前期研究中，已经发现多个菌株能够合成乙偶姻。Hespell等人以木聚糖、玉米 纤维、糖类底物利用多粘芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa)发酵最高可生产大约11.lgL1的 乙偶姻：Cho等人筛选到一株产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca)Ml，发现对该菌发酵 过程中pH进行控制，可以影响到产物中乙偶姻和2,3_ 丁二醇的比例，并发现该菌中催化乙 偶姻到2, 3-丁二醇的关键酶基因受到pH诱导：Fan等人在日本纳豆中筛选到可以生产乙 偶姻的B.subtilis，在摇瓶中单独培养该菌可得到大约33. 90gL1的乙偶姻；Xiao等人筛 选到耐热的芽孢杆菌，可以在最适45°C条件下生产乙偶姻和2, 3-丁二醇；Xu等人筛选到一 株高产乙偶姻的B.subtilis，并利用诱变的方法将乙偶姻产量提高到46. 9gL%江南大学 李华钟等人筛选到一株高产乙偶姻的B.subitlis，该菌株可以生产大约42. 2gL1的乙偶 姻。上述报道集中在芽孢菌以及克雷伯氏菌中，开发具有较好性能的新菌株既有较好的理 论研究价值和应用意义。此外，葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有 较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压， 对于提高产物的浓度具有重要意义。因此，本发明的目的是，提供一种新的耐受高浓度葡萄 糖的葡萄球菌，并且利用该菌株生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明针对目前以葡萄糖为原料合成乙偶姻的菌株来源窄，特别是工业菌株 的高浓度葡萄糖耐受性需要提升的现状，筛选获得高浓度葡萄糖耐受性的葡萄球菌 (Staphylococcussp.)，并且利用该菌株生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的方法。
[0005] -种耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌（Staphylococcussp.)，其保藏编号为：CGMCC No. 10671，保藏日期为2015年3月30日。
[0006] 所述CGMCCNo. 10671葡萄球菌是从湖南永州白芒烟草试验站烟田土壤中通过选 择性培养基分离得到的。
[0007] 其具有如下生物学特征：
[0008] 球形或稍呈椭圆形，直径1.0ym左右，排列成葡萄状。无鞭毛，不能运动，无芽胞， 革兰氏染色为阳性。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的浅黄色小菌落，菌落干，边缘 整齐。
[0009] 上述葡萄球菌菌株的经通用引物PCR获得16SrDNA序列与其它多株葡萄球菌的 16SrDNA序列有99%的相似性但是不同。
[0010] 其中上述PCR的引物为fDl:AGAGTITGATCCTGGCTCAG，
[0011] rP2 ：CGGCTACCTTGTTACGACTT〇
[0012] 进一步的，本发明还公开了CGMCCNo. 10671的葡萄球菌的应用方法，具体为利 用保藏编号为：CGMCCNo. 10671的葡萄球菌在耐受高浓度的糖的情况下生产乙偶姻和2， 3_ 丁二醇。
[0013] 所述葡萄球菌能够在高葡萄糖浓度的乙偶姻筛选培养基里快速生长并产生乙偶 姻和2, 3-丁二醇；
[0014] 耐受高浓度葡萄糖产乙偶姻的菌株的筛选配方：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏 2 ~10g/l，NaCl3 ~6g/l，葡萄糖 300 ~500g/L，pH值 7. 0 ~7. 4,最佳温度为 30 ~37°C，
[0015] 培养时的转速为100~140r/min，
[0016] 生产乙偶姻和2, 3, - 丁二醇的菌株培养在250ml的三角瓶中的装液量为40~ 80ml，
[0017] 生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的培养时间为36~48小时，
[0018] 生产乙偶姻和2, 3-丁二醇的培养基的灭菌条件为110~120°C灭菌20~30分 钟。
[0019] 进一步的，按照所述葡萄球菌能够在高葡萄糖浓度的乙偶姻筛选培养基里快速生 长并产生乙偶姻和2, 3- 丁二醇的操作方法，
[0020] 该葡萄球菌能够在含有500g/L的葡萄糖的培养基中生长，在摇瓶发酵水平上能 够产生至少45g/L的乙偶姻和至少12. 5g/L的2, 3- 丁二醇。
[0021] 进一步的，生产乙偶姻和2,3_ 丁二醇的复合氮源还可以为：酵母浸膏、氯化铵、尿 素等，碳源还可以为：蔗糖、果糖麦芽糖等。即利用上述耐受高浓度葡萄糖的葡萄糖菌生产 乙偶姻和2,3_ 丁二醇的的复合氮源可以是牛肉膏或蛋白胨，但不局限于牛肉膏和蛋白胨， 碳源为葡萄糖，单不仅限于葡萄糖。
[0022] 本发明的葡萄糖菌株是一种分离的全新的菌株，该菌株该菌株具高浓度葡萄糖耐 受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物比较单一，主要为乙偶 姻和2, 3-丁二醇，利于进行后期的基因工程改造和发酵生产。葡萄糖的耐受度是菌株工业 应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同 时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。
[0023] 保藏信息：
[0024] 菌株名称：葡萄球菌（Staphylococcussp.)
[0025] 参据的生物材料（株）CAS-513-86-0-HNYZ
[0026] 保藏日期：2015年3月30日
[0027] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)
[0028] 保藏编号：CGMCCNo. 10671
[0029] 地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0030] 图1筛选获得菌株的高浓度葡萄糖耐受性。
[0031] 图2摇瓶发酵葡萄球菌生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇。[乙偶姻和2, 3- 丁二醇的气 相-质谱鉴定（a-乙偶姻；b. 2, 3- 丁二醇）]
【具体实施方式】
[0032] 一、菌株筛选
[0033] L培养基及培养条件：
[0034] 耐受高浓度葡萄糖产乙偶姻的菌株的筛选配方为：胰蛋白胨3~8g/l，牛肉膏 2 ~5g/l，NaCl3 ~5g/l，MgS04.7H20,2 ~4g/l，葡萄糖 300 ~500g/l，pH值 7. 0 ~7. 4。 最佳温度为30~37 °C，转速为100~140r/min，在250ml的三角瓶中的装液量为40~ 80ml〇
[0035] 培养时间为24~36小时。
[0036] 上述烟培养基的灭菌条件为112°C灭菌30分钟。
[0037] 上述培养基中添加1 %~1. 5%的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。2.筛选 方法：
[0038] 取污水、污泥以及腐败生物质的土壤按照lg样品5ml水溶解，将水样置于室温24 小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均 勾，以此类推制成10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6不同稀释度的土壤。
[0039] 取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到以添加1%~1. 5%的琼脂的含有高浓度葡萄 糖的培养基制成的固体培养基培养皿上，
[0040] 上述菌落的产乙偶姻筛选方法为：将10%NaOH、5 % 1-萘酚（正丙醇溶解）、0. 5% 肌酸的溶液按照1 : 1 : 1的比例混合，并与加热后熔化的固体LB培养基混匀（显色液加 入量约占培养基总体积的10% )，然后倒于长有目标菌落且含有高浓度葡萄糖的平板上， 等待半小时观察颜色变化。
[0041] 上述筛选获得菌株，培养36小时后挑取单菌落进行液体培养，葡萄糖耐受性试 验。经筛选共获得菌株4余株，进行摇瓶培养后测定乙偶姻和2, 3- 丁二醇的产量。
[0042] 二、葡萄糖耐受性的验证
[0043] 取上述菌株筛选培养基，按照1~5%的接种量接种活化后的葡萄球菌，接种于装 有2mlLB培养基的试管中，生长到菌体密