度为0D600大约1左右时接种于装有50ml以葡萄 糖含量在100~500g/L的上述培养基的250ml的摇瓶中，于120转每分钟的摇床中，30~ 37°C培养。培养36~48小时测定该菌株的生长量。
[0044] 生长量的测定：取上述菌液lml，经12 000r/min离心2~5min后，利用蒸馏水重 悬，稀释适当倍数后，利用紫外-可见分光光度计于600nm处测定吸光度。经测定，该菌株 能够耐受500g/L以上的葡萄糖浓度，其结果如图1所示，图1筛选获得菌株的高浓度葡萄 糖耐受性。在糖浓度100_300g/L的范围内，菌株的生长量逐渐增加，在300g/L葡萄糖浓度 下表现出最大生长量，随着糖浓度的进一步增加，菌株的生长量逐渐减小。
[0045] 三、菌株16SrDNA鉴定
[0046] 1 ?培养基及材料
[0047] LB培养基含有以下成分：蛋白胨8~12g/l，酵母粉4~6g/l，氯化钠1~4g/l， pH7. 0 ~7. 5,112°C灭菌 25 ~35 分钟。
[0048] LA培养基：在LB培养基中添加40~100yg氨苄青霉素。
[0049] LB/LA固体培养基：在上述LB/LA培养基中添加1. 5%的琼脂。
[0050] TAE:50 倍tris-acetate-EDTA(2Mtris-acetate，0? 05MEDTA，pH8. 3)?
[0051] 琼脂糖电泳凝胶：1倍TAE电泳缓冲液添加0. 8~1. 2 %的琼脂糖凝胶。2. 16S rDNA测定
[0052] 基因组DNA的提取，在LB液体培养基中生长的1-1菌体（约12~24小时）离心。 提取基因组DNA，然后用浓度为1 %的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测合格的 DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为
[0053] fDl：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,
[0054] rP2：CGGCTACCTTGTTACGACTT；
[0055] PCR模板DNA添加0. 5yl调节到合适浓度，引物浓度为0. 4yM，dNTP浓度为 0. 2mM，DNA聚合酶大约2. 5U，反应总体积50y1，变性温度为94°C，退火温度为55°C，延伸温 度72°C，共30个循环。PCR产物约为1. 5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分 析仪检测，经PCR扩增得到的DNA电泳检测后连接到PMD18-T转化大肠杆菌，转化的DH5a 菌株经过添加LA(Luria-Bertani培养基添加50mg氨节青霉素）培养基筛选后，提取质粒 进行电泳验证，将正确质粒进行测序，测序结果如sequence1所示。
[0056] Sequence1 :
[0057]
[0058] 将本发明的菌株的16SrDNA序列与GenBank中已登录的16SrDNA序列进行同源 比较，该16SrDNA序列与其它多株葡萄球菌的16SrDNA序列相似但不完全相同。球形或稍 呈椭圆形，直径l.Oym左右，排列成葡萄状。无鞭毛，不能运动，无芽胞，革兰氏染色为阳 性。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的浅黄色小菌落，菌落干，边缘整齐。根据16S rDNA序列和形态学特征，鉴定该菌为葡萄球菌。
[0059] 四、摇瓶发酵生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇
[0060] 产乙偶姻培养基配方为：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏2~10g/l，NaCl3~6g/l， 葡萄糖300~500g/L，pH值7. 0~7. 4。最佳温度为30~37°C，培养方法的转速为100~ 140r/min〇
[0061] 取上述培养基，按照1~5%的接种量接种活化后的葡萄球菌，接种于装有2mlLB 培养基的试管中，生长到菌体密度为0D600大约1左右时接种于装有50ml上述培养基的 250ml的摇瓶中，培养36~48小时后测定乙偶姻和2, 3- 丁二醇的产量，（产物经气相-质 谱定性，如图2,图2摇瓶发酵葡萄球菌生产乙偶姻和2, 3-丁二醇，（a.乙偶姻；b. 2, 3-丁 二醇））。图2展示了两种发酵主产物GC-MS色谱分析结果，其中横坐标代表质核比，纵坐标 代表离子强度，图中的化学物质结构是色谱分析结果与标注库作对比后挑选出的与样品色 谱图最为相近的化学物质的结构。分析结果表明两种主要产物分别为：乙偶姻和2,3 丁二 醇。
[0062] 每次取样时取样1ml于1. 5ml离心管，12000rpm离心2min，吸取上清液，备用。
[0063] 乙偶姻含量测定方法（分光光度法）：乙偶姻标准溶液：称取乙偶姻（88.llg/ mol)标准品0. 01762g溶于100ml水制成2mM的乙偶姻溶液。0. 5%肌酸：称取肌酸0. 5g， 溶于100ml水，4°C保存；5%a-萘酚：a-萘酚〇. 5g溶于10ml乙醇，4°C保存；40%K0H: KOH40g，溶于 100ml水，4°C保存。
[0064] 标准曲线的制备：将2mM的乙偶姻溶液梯度稀释成0. 2mM、0. 15mM、0.lmM、0. 05mM， 以蒸馏水为对照，分别取上述溶液200y1于1. 5ml离心管，依次加入140y1肌酸溶液， 200y1a-萘酚，200y1的K0H溶液。每加入一种试剂均需涡旋震荡。所有试剂加完后室 温下温育15min，测样前再次涡旋震荡，用分光光度计在560nm波长下测吸光度值。得到乙 偶姻溶液吸光度变化与浓度间的标准曲线。
[0065] 乙偶姻样品浓度测定：取试样200y1于1. 5ml离心管，按照上述显色步骤进行显 色，560nm波长下测吸光度值，由标准曲线求得试样中乙偶姻的浓度45g/L。
[0066] 2, 3- 丁二醇检测：2, 3- 丁二醇的检测采用气象法，检测室温度270°C，气化室温度 250°C，柱室温度初始温度为50°C，2min，20°C/min升温到120°C后30°C/min升温到240°C， 保持5min后降温到50°C，完成检测。根据2, 3- 丁二醇的纯品绘制标准曲线，利用标准曲线 求得2, 3- 丁二醇的浓度为12. 5g/L。
[0067] 综上，本发明的葡萄糖菌株是一种分离的全新的菌株，该菌株该菌株具高浓度葡 萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物比较单一，主要 为乙偶姻和2, 3-丁二醇，利于进行后期的基因工程改造和发酵生产。葡萄糖的耐受度是菌 株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底 物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。
【主权项】
1. 一种耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌（Staphylococcus sp.)，其保藏编号为：CGMCC No. 10671，保藏日期为2015年3月30日。2. -种耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌的应用方法，其特征在于，利用保藏编号为： CGMCC No. 10671的葡萄球菌在耐受高浓度的糖的情况下生产乙偶姻和2, 3-丁二醇。3. 根据权利要求2所述葡萄球菌的应用方法，其特征在于，所述葡萄球菌能够在高葡 萄糖浓度的乙偶姻筛选培养基里快速生长并产生乙偶姻和2, 3- 丁二醇； 耐受高浓度葡萄糖产乙偶姻的菌株的筛选配方：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏2~IOg/ 1，NaCl 3~6g/l，葡萄糖300~500g/L，pH值7. 0~7. 4,最佳温度为30~37°C， 培养时的转速为100~140r/min， 生产乙偶姻和2, 3, - 丁二醇的菌株培养在250ml的三角瓶中的装液量为40~80ml， 生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的培养时间为36~48小时， 生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的培养基的灭菌条件为110~120°C灭菌20~30分钟。4. 根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，生产乙偶姻和2, 3- 丁二醇的复合氮 源还可以为：酵母浸膏、氯化铵、尿素，碳源还可以为：蔗糖、果糖、麦芽糖。
【专利摘要】本发明提供了一种耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌(Staphylococcus？sp.)，其保藏编号为：CGMCC？No.10671，保藏日期为2015年3月30日。并且提供了利用保藏编号为：CGMCC？No.10671的葡萄球菌在耐受高浓度的糖的情况下生产乙偶姻和2，3-丁二醇的应用方法。该菌株具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物比较单一，主要为乙偶姻和2，3-丁二醇，利于进行后期的基因工程改造和发酵生产。CGMCC No.1067120150330
【IPC分类】C12N1/20, C12P7/18, C12R1/44, C12P7/26
【公开号】CN105112335
【申请号】CN201510579109
【发明人】王倩, 刘好宝, 苏玉龙
【申请人】中国农业科学院烟草研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月6日