乙脑恢复病毒rJEV在小鼠神经毒力方面与乙脑疫苗株完全一致，可 以作为基因骨架进行嵌合病毒疫苗的构建。
[0064] 表2恢复病毒神经毒力检测
[0066] 二、本发明乙脑/黄热嵌合病毒的制备和鉴定
[0067] 1、黄热病毒17D株prM/E蛋白编码基因的扩增
[0068] I. 1黄热病毒RNA的抽提
[0069] 黄热减毒活疫苗由北京天坛生物制品股份有限公司生产，按说明书溶解冻干粉 剂，取400 μ 1病毒液用Roche公司生产的RNA提取试剂盒（High pure viral RNA kit)进 行RNA的抽提（按说明书进行），RNA保存于-80°C备用。
[0070] 1. 2病毒cDNA的逆转录
[0071] 以提取的病毒RNA (分别取11 μ 1)为模板，用随机引物进行逆转录，合成cDNA，所 用试剂盒为 Invitrogen 公司 Superscript? III Reverse Transcriptase，引物由上海英 潍捷基生物技术有限公司合成，方法参照试剂盒说明书进行。
[0072] L 3黄热病毒prME插入片段的PCR扩增
[0073] 取 2 μ 1 病毒 cDNA 为模板，分别用引物 JEV473F 和 FUSION-R、FUSION-F 和 EV2650R 配对扩增相应的片段（引物信息见表3)，所用DNA聚合酶为NEB公司的Phusion?超保真 DNA聚合酶，用降落PCR(Touch-down PCR)进行扩增，扩增条件为：98°C 2min ;98°C lOsec， 58. 5°C - 53. 5°C IOsec 72°C，2min，10 循环；98°C IOsec 53. 5°C 10sec，72°C，2min，20 循 环；72°C10min。扩增的2个片段各取5ul作为模板，进行融合PCR，条件同上。扩增出覆 盖黄热病毒PrME基因以及乙脑病毒SA14-14-2的E蛋白基因最后9个核苷酸和NSl基因 前187个核苷酸的片段，命名为17DprME+。
[0074] 表3黄热病毒prME+NSl部分片段的PCR扩增引物
[0076] 2、乙脑/黄热嵌合片段Y半分子质粒pJE/YF-5^的构建
[0077] 将扩增的基因片段17DprME+(包含乙脑病毒SA14-14-2的E蛋白基因最后9个核 苷酸和NSl基因前187个核苷酸的片段）用限制内切酶KasI和BglII酶切，回收2. Ikb的 DNA片段，同时用相同的两个限制内切酶切割5'半分子克隆pACNR-JEV5'，并回收大片段 (4. Okb)，将两个片段连接并转化感受态细胞T0P10,挑选阳性克隆并进行酶切和测序鉴定， 并命名为PJE/YF-5'(图8)。
[0078] 3、乙脑/黄热全长cDNA克隆的构建及鉴定
[0079] 将构建的乙脑/黄热V半分子质粒pJE/YF-5^和乙脑Y半分子质粒 PACNR-JEV3'同时用限制内切酶BspEI和XhoI酶切，分别回收大小为6. Ikb和7. 5kb的 DNA片段，连接并转化感受态细胞T0P10,挑选阳性克隆即为乙脑/黄热全长cDNA克隆，命 名为PJYF-FC(图9A);通过对pJYF-FC进行HindIII酶切验证，结果表明可产生4条预期 大小条带，分别是95416?、200(^?、13926?和6136?，和预期一致（图98) ;对？几?4(：进行 全长测序结果表明，PJYF-FC没有发生任何突变和预期一致。
[0080] 本发明本发明乙脑/黄热嵌合病毒的CDNA克隆（PJYF-FC)的核苷酸序列（SEQ ID NO. 1)为：
[0081] agaagtttatctgtgtgaacttcttggcttagtatcgtagagaagaatcgagagattagtgcagtttaa acagttttttagaacggaagataaccatgactaaaaaaccaggagggcccggtaaaaaccgggctatcaatatgctg aaacgcggcctaccccgcgtattcccactagtgggagtgaagagggtagtaatgagcttgttggacggcagagggcc agtacgtttcgtgctggctcttatcacgttcttcaagtttacagcattagccccgaccaaggcgctttcaggccgat ggaaagcagtggaaaagagtgtggcaatgaaacatcttactagtttcaaacgagaacttggaacactcattgacgcc gtgaacaagcggggcagaaagcaaaacaaaagaggaggaaatgaaggctcaatcatgtggctcgcgagcttggcagt tgtcatagcttgtgcaggcgccgtgaccttggtgcggaaaaacagatggttgctcctaaatgtgacatctgaggacc tcgggaaaacattctctgtgggcacaggcaactgcacaacaaacattttggaagccaagtactggtgcccagactca atggaatacaactgtcccaatctcagtccaagagaggagccagatgacattgattgctggtgctatggggtggaaaa cgttagagtcgcatatggtaagtgtgactcagcaggcaggtctaggaggtcaagaagggccattgacttgcctacgc atgaaaaccatggtttgaagacccggcaagaaaaatggatgactggaagaatgggtgaaaggcaactccaaaagatt gagagatggttcgtgaggaaccccttttttgcagtgacggctctgaccattgcctaccttgtgggaagcaacatgac 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