基中分别含15、20体积份血清替代物的两个浓度组中，出现和低浓度组相同的状况，细胞生长缓慢，细胞扁平化，轮廓清晰(见图1B)。
[0091](二)重组人碱性成纤维生长因子的含量筛选
[0092]受试培养基:0.1体积份的0-巯基乙醇，1、2、5、8、10、12、15、18或201^/1111的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco 公司)，10 体积份的 KnockoutFBS 血清替代物(10828-028，Gibco 公司),89体积份的a-MHM。
[0093]参考第(一)部分方法，以相同细胞源、相同密度接种，加12_15mL常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
[0094]结果:在培养基中分别含l、2ng/ml bFGF的两个浓度组中，细胞增殖缓慢，细胞状态差，呈现营养不足状态(参见图1C);在培养基中分别含5、8、10、12、15ng/ml bFGF的浓度组中，细胞正常生长，亮度高，生长好；在培养基中分别含18、20ng/ml bFGF的浓度组中，细胞增殖良好，明亮，但经过多次传代过程中，细胞易分化，细胞会成团状汇集，或触角变长(参见图1D) ο
[0095]实施例2红细胞裂解液辅助提取脐带间充质干细胞的方法
[0096]样本的采集与运输:无菌条件下采集剖宫产新生儿脐带样本，放入含青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素Β的脐带保存运输液(D-Hank’s液中青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素在保护液中的终浓度均为150U/mL，两性霉素B终浓度为300U/ml)，2小时内冰上运输至洁净GMP细胞实验室；
[0097]样本的清洗和消毒:在生物安全柜柜内，将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75%酒精冲洗2遍，再用无菌生理盐水冲洗3次；
[0098]脐带组织的预处理:用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳去除两条脐动脉和一条脐静脉，钝性分离外层羊膜置于50ml离心管，加2-5倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0099]红细胞裂解液处理:将外层羊膜组织重新分别转移至洁净的无菌培养皿，剪成1-3_3大小组织块；将肉糜状脐带组织块重新转移至离心管，重新加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温处理3分钟，然后1200rpm、4°C下离心6分钟，弃上清，收集组织块；其中红细胞裂解液包含5g/L的NH4C1和0.1mM Na2_EDTA，pH为7.2-7.4 ；
[0100]原代培养:将肉糜状外层羊膜组织块均匀铺在100mm无菌培养皿上，覆盖70%皿底面积，每皿加4倍约10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至3天时将平皿从培养箱中移出，补加5ml新鲜培养基；在7天，待组织块下均匀爬出细胞(图2A)，去掉组织块，加5ml PBS轻微晃动清洗，吸弃PBS，每皿加10ml新鲜培养基，此后每3天进行一次换液；其中采用的间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β -巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、10体积份的Knockout?血清替代物、89体积份的a_MEM/DMEM_F12和终浓度为10ng/ml的b_FGF ；
[0101]细胞传代:组织块铺平皿第12天，贴壁细胞汇合率达50%左右时，质量分数为
0.125%胰酶消化1-2分钟(消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁)后，4°C下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，再接种于T75细胞培养瓶中，采用间充质干细胞无血清培养基传代培养，直至汇合率达80-90%，收集细胞或继续进行传代培养。传代后培养的成纤维状细胞形态见图2B。
[0102]实施例3红细胞裂解液辅助提取脐带间充质干细胞的方法
[0103]采用的红细胞裂解液包含10g/L的NH4C1和(λ ImM Na2_EDTA，pH为?.2-7.4。
[0104]参考实施例2的方法进行，培养至第5天有间充质干细胞从组织块底爬出，在第7天左右间充质干细胞形成旋涡状细胞团，去除组织块更换新鲜培养基后，第12天左右，细胞汇合达60 %，胰酶消化后传代；传至第三代后细胞纯度大于99 %，活力大于95 %。
[0105]实施例4不使用红细胞裂解液提取脐带间充质干细胞的方法
[0106]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，不经红细胞裂解液处理，直接均匀铺在100mm无菌培养皿上，覆盖70%皿底面积，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养。在9天，组织块下爬出细胞，但有大量红细胞贴在皿底，占据干细胞贴壁空间(图2C)，贴壁效果差，细胞生长状况不佳。
[0107]实施例5不同浓度红细胞裂解液提取间充质干细胞的方法
[0108]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，分别加入含1、2、5、7、10、15或20g/L的NH4C1与0.1mM Na2-EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，处理2分钟，然后将细胞直接均匀铺在100mm无菌培养皿上，覆盖70%皿底面积，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养。观察细胞生长情况。
[0109]结果:经其中NH4C1浓度为1或2g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；经其中NH4C1浓度为5、7或10g/L的红细胞裂解液处理后，皿底红细胞较少，间充质干细胞爬出时间短(5-7天)；经其中NH4C1浓度为15或20g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底无红细胞，但间充质干细胞爬出时间长(7-12天)。
[0110]实施例6不同时间红细胞裂解液处理脐带提取间充质干细胞的方法
[0111]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，加入含5g/L的NH 4C1与0.1mM Na2-EDTA的红细胞裂解液(pH为
7.2-7.4)，分别处理脐带组织块1、2、5、7或10分钟后，然后将细胞直接均匀铺在100mm无菌培养皿上，覆盖70%皿底面积，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养。观察细胞生长情况。
[0112]结果:在处理时间为1分钟的组中，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；在处理时间为2或5分钟的组中，皿底红细胞较少，间充质干细胞爬出时间短(5-7天)；在处理时间为7或10分钟的组中，平皿底无红细胞，但间充质干细胞爬出时间长(7-12天)，细胞量极少，生长出的间充质干细胞扩增缓慢。
[0113]实施例7脐带间充质干细胞形态学鉴定
[0114]通过实施例2的分离培养，脐带单个核细胞在细胞铺平板第3天后观察到，显微镜下可见明亮贴壁圆形细胞。培养5天后在显微镜下可见到明亮贴壁圆形细胞伸出触角，呈梭形贴壁状，在10天左右形成旋涡状细胞团出现。消化传代培养过程中，细胞形态均一，增殖快，传代过程细胞状态稳定。
[0115]实施例8流式细胞仪分析脐带间充质干细胞的表面标志
[0116]取实施例3分离培养的第3代细胞，待细胞生长至90%汇合后，2mL0.125%胰酶消化，然后在4°C下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1 X 105转移至流式管，分别加 5 μ L CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、IgGl_PE(同型对照)和 IgGl_FITC(同型对照)抗体，混匀4°C下避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500 μ L PBS缓冲液重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XL，Beckman公司)，每个样本收集1 X 104细胞。
[0117]细胞免疫表型如下:
[0118]阳性比例:CD29>99.0%，CD44>99.0 %，CD73>99.0 %，CD105>99.0 %,CD90>99.0%，HLA-ABC 99.0% ；
[0119]阳性比例:CD34<1.0%, CD45<1.0%, HLA-DR<1.0%o
[0120]结果参见图3。
[0121 ] 实施例9细胞活力仪分析脐带间充质干细胞的细胞活力、生长特性
[0122]将实施例2分离培养的第二代细胞接种到T25培养瓶中，待细胞达到95% -100%汇合后，0.125%胰酶消化，收集细胞以1X105/孔密度接种于两个6孔板。待细胞全部贴壁生长10小时后，收集两孔细胞加500 μ L PBS制成细胞悬液，上机分析(细胞活力分析仪V1-Cell XR，Beckman公司)。此后每12小时取样分析，绘制生长曲线。
[0123]结果参见图4，表明脐带间充质干细胞活性在99.7%以上，细胞直径分布在9-12 μ m，成梭形旋涡状生长的脐带间充质干细胞消化后具有完整圆度，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
[0124]实施例10脐带间充质干细胞多向分化潜能的鉴定
[0125]成骨诱导分化
[0126]将实施例2分离培养的第4代脐带多能干细胞以3X 104细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，24小时后，每孔添加新鲜配制的人UC MSC成骨诱导分化培养基(HUXUC-90021，赛业产品)2mL，此后每3天更换新鲜的成骨分化诱导培养基，2周后多聚甲醛固定，茜素红染色3-5分钟