。同时以RT-PCR鉴定成骨标志基因0ΡΝ在转录水平的表达情况。
[0127]结果参见图5，表明以本发明方法得到的脐带间充质干细胞在成骨诱导两周后，茜素红与成骨过程的钙结节发生深红色显色反应，另外成骨标志基因0ΡΝ也在诱导前后出差异表达。
[0128]成脂诱导分化
[0129]将实施例3分离培养的第4代脐带多能干细胞以2X 104细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，待细胞达到100%汇合后，每孔添加成脂诱导分化培养基A液(HUXUC-90031，赛业产品)开始诱导，3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时，如此循环。当脂滴出现较多但较小时，用成脂诱导液B维持7天，诱导结束后4%多聚甲醛固定，油红0染色；同时以RT-PCR鉴定成骨标志基因PPAR-γ在转录水平的表达情况。
[0130]结果参见图6，表明以本发明方法得到的脐带间充质干细胞在成脂诱导两周后，油红0对成脂细胞着色明显，另外成脂标志基因PPAR-γ也在诱导前后出差异表达。
[0131]实施例11 RT-PCR分析脐带间充质干细胞多能性基因
[0132]将实施例2分离培养的第3代脐带多能干细胞以5X 105细胞/cm 2的密度接种于T25细胞培养瓶中，2-3天后至细胞100%汇合收集细胞，抽提RNA，将抽提的RNA反转录得到cDNA样本，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后移至凝胶成像仪观察。
[0133]结果参见图7，表明脐带多能性标志基因NANOG、0CT4、S0X2以及SSEA4有明亮程度不同的条带。
[0134]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【主权项】
1.一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括:采用红细胞裂解液处理从脐带分离的外层羊膜组织，并采用间充质干细胞无血清培养基进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，优选为包含l_20g/L的NH4C1和0.05-0.2mM Na2-EDTA的水溶液，更优选为包含 5-10g/L 的 NH4C1 和 0.1mM Na2_EDTA 的水溶液，pH 为 7.2-7.4。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b_FGF)和血清替代物； 优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β -巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a_MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸； 更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β -巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子； 最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F 12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括:将获得的外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后采用间充质干细胞无血清培养基培养获得的外层羊膜组织块，以获得原代间充质干细胞； 优选地，所述方法包括:将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后将获得的组织块均匀铺在培养皿中达60-80%的覆盖，加入3-5倍组织块体积的间充质干细胞无血清培养基，在37 °C和5%浓度的0)2下培养，3-5天时半量更换新鲜培养基，5-15天时待组织块下均匀爬出细胞后，去掉组织块，全量更换新鲜间充质干细胞无血清培养基继续培养，此后每3-4天进行一次新鲜培养基更换。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)脐带组织的预处理: 将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜组织，加入PBS缓冲液清洗； (2)红细胞裂解液处理: 将经步骤(1)获得的外层羊膜组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗； (3)原代培养: 采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(2)获得的外层羊膜组织块，以获得原代间充质干细胞； 优选地，所述方法还包括以下步骤: (4)上清液检测: 取步骤⑶中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素； (5)传代培养: 取步骤(4)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞备用、冻存或继续传代； (6)细胞检测: 取步骤(5)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括:将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜组织，加入3-5倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗； 优选地，所述步骤(2)包括: 将经清洗的外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟； 优选地，所述步骤(3)包括: 将经步骤(2)获得的组织块均匀铺在培养皿中达60-80%、优选70%的覆盖，加入3-5倍组织块体积的间充质干细胞无血清培养基，在37°C和5%浓度的0)2下培养，3-5天时半量更换新鲜培养基，5-15天、优选7-10天时待组织块下均匀爬出细胞后，去掉组织块，全量更换新鲜培养基继续培养，此后每3-4天进行一次新鲜培养基更换； 优选地，所述步骤(4)包括: 取步骤(3)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素； 优选地，所述步骤(5)包括: 取步骤(4)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达30-80%、优选40-50%时，胰酶消化后离心收集细胞，采用间充质干细胞无血清培养基传代培养至汇合率达50-90 %、优选80-90 %，收集细胞备用、冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125%，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟； 优选地，将收集的细胞以2-3X106细胞/ml的密度冷冻保存在_196°C液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代； 优选地，所述步骤(6)包括: 取步骤(5)中培养的细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理； 优选地，所述处理包括: 无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75%乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次； 其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank’ s液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml ;两性霉素B的浓度为200-400U/mL，优选300U/mL。8.通过权利要求1至7中任一项所述的方法获得的间充质干细胞。9.根据权利要求8所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞具有以下特征: (1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长； (2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和 HLA-ABC 的阳性比例大于 99.0% ;CD45、CD34 和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ; (3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞； (4)活细胞检测比率达99%以上； (5)呈典型的“S型”生长曲线特性； (6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、0CT-4、NAN0G和SOX-2中的一种或多种。10.权利要求2所述的红细胞裂解液和/或权利要求3所述的间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。11.一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的红细胞裂解液和/或权利要求3所述的间充质干细胞无血清培养基。
【专利摘要】本发明提供一种从人脐带组织稳定高效地分离提取间充质干细胞的方法。该方法利用健康新生儿的脐带组织，经过清洗消毒，机械剪碎，分离外层羊膜，经红细胞裂解液处理后以无血清培养基悬浮培养。每3-5天进行换液，平皿内贴壁率达30-70％后利用胰酶消化后，离心收集细胞传代扩增，至细胞汇合率达80-90％汇合，即得到高纯脐带间充质干细胞。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105420184
【申请号】CN201510918960
【发明人】郭镭
【申请人】郭镭, 里程, 圣释（北京）生物工程有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月11日