，pH7.0， 121°C灭菌 20min;
[0049] 将活化后的新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069按2% (质 量百分比）的接种量接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基（培养基组成及质量：根皮苷 0.96g、MgS〇4.7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl0.2g、蒸馏水定容至 1000mL，pH7.0，121°C灭菌 20min)，30°C、160r/min摇床培养并测定根皮苷降解率。
[0050] 结果表明：培养 12h后新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069 菌株对根皮苷的降解率达81 .78%，培养24h后新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium 3油3代丨化11111)410：100069菌株对根皮苷降解率可达96.88%。对根皮苷具有显著的降解效 果。
[0051 ]将活化后的新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069按2% (质 量百分比）的接种量接种到含2mmol/L的绿原酸、间苯三酚、焦性没食子酸、对羟基苯甲酸、 丁香酸、咖啡酸、苯甲酸七种不同的酚酸液体培养基（培养基组成及质量：酚酸类物质 0.96g、MgS〇4.7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl0.2g、蒸馏水定容至 1000mL，pH7.0，121°C灭菌 20min)，30°C、160r/min摇床培养12h后测定对不同酸酸类物质降解率。结果表明该菌对七 种酚酸类物质均具有一定的降解能力。
[0052] 表1AMCC100069菌株对不同酚酸的降解谱（12h)
[0054]二、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株对根皮苷的 降解曲线
[0055] 将活化后的新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069按2% (质 量百分比）的接种量接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基（培养基组成及质量：根皮苷 0.96g、MgS〇4.7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl0.2g、蒸馏水定容至 1000mL，pH7.0，121°C灭菌 20min)，30°C、160r/min摇床培养20h，每隔4h取一次样8000r/min离心10min收集发酵液。用 乙酸乙酯跟发酵液(V:V)1:1的比例萃取发酵液中的根皮苷，取有机相进行旋转蒸发最后溶 于2mL的甲醇中，13000r/min离心10min去蛋白，上样前用0.45μηι的滤膜过滤，然后用高效液 相色谱仪(C18柱)测定根皮苷的残余量，计算根皮苷的降解率并测定菌体生长情况。
[0056]检测条件为:检测波长为270nm，柱温30°C，进样量为10yL，体积分数0.6 %的乙酸 水溶液(95%)与乙腈(5%)以流速lmL/min洗脱40min。
[0057] 结果表明：随着处理时间的增加，处理组的根皮苷的降解率不断增高，且在新鞘氨 醇杆菌(1^〇￥〇8口11；[1^013；[111113油&1'01:;[011111)4]\0^100069菌株菌体生长量和根皮苷降解率间呈 正相关（图2)。
[0058] 实施例3、微生物有机肥的制备及盆栽试验
[0059] -、微生物有机肥的制备
[0060] 1 ·将新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌株菌株接种到 活化培养基中进行活化培养24h，温度为28~30°C、搅拌转速为180~200r/min;
[0061 ]活化培养基每升组分如下：
[0062] 根皮苷〇.96g、MgS〇4·7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0， 121°C灭菌20min;
[0063] 将活化后的新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069按2% (质 量百分比）的接种量接种到发酵培养基中，发酵温度为28~30°C、搅拌转速为180~220r/ min，使发酵液中菌体含量不少于1.OX101()cfu/g;
[0064] 发酵培养基每升组分如下：
[0065] 根皮苷0.96g、MgS〇4.7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl 0.2g、蒸馏水1000mL，pH 7.0，121 °C灭菌20min。
[0066] 2·将40L所述新鞘氨醇杆菌（NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌株的 发酵液与1吨有机肥混合均匀，制得有效活菌数2~4X108cfu/g的生物有机肥。
[0067] 所述有机肥可为符合NY 525(有机肥料)标准要求的有机肥料。所述有机肥具体可 为烟台市绿源有机肥有限公司生产的绿霞有机肥料。得到所述生物有机肥料中有效活菌数 为2~4X108cfu/g;
[0068] 二、盆栽试验
[0069] 在山东农业大学国家苹果工程科技研究中心基地进行盆栽试验。将新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基(培 养基组成及质量：根皮苷〇.96g、MgS〇4.7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl 0.2g、蒸馏水定容至 1000mL，pH 7.0,121°C灭菌20min)中30°C、160r/min培养12小时，离心收集菌体，然后用无 菌水洗涤重悬使其菌悬液的浓度为1 X 108CFU/mL，备用。
[0070] 取已长4~6片真叶的平邑甜茶实生苗进行盆栽，按常规管理进行灌溉及清除杂 草，栽培5个月后检测各指标。具体实验设计如下：
[0071] 表2盆栽实验设计
[0072]
[0073] 注:一表示未添加。
[0074] 结果表明：与CK相比，ΤΙ处理地上、地下部鲜重分别减少约31.24%、43.41 % (P〈 0.01)，表明高浓度的根皮苷对植株生长具有极显著的抑制作用；T2处理地上、地下部鲜重 分别增加约18.67 %、18.81 % (Ρ〈0.01) ;Τ3处理地上、地下部鲜重分别增加约135.68、 93 · 87% (Ρ〈0 · 01)。表明加入新鞘氨醇杆菌（NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌 液的处理和加入包含新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌株的生 物有机肥的处理都对对植株生长具有极显著的促进作用，并可有效缓解因高浓度根皮苷积 累而造成的苹果连作障碍问题。（如表3所示）
[0075] 表3不同处理植株的生物量
[0076]
[0077] 注:在同一行中的平均数据采用多重比较，凡尾部标有不同字母的数值表示它们 之间有显著差异（小写字母P〈〇.05,差异达显著水平；大写字母P〈0.01，差异达极显著水 平)。
【主权项】
1. 一株新鞘氨醇杆菌（NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069,于2015年7月31 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCCNo. 11163。2·权利要求1所述新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069在制备 缓解果树连作障碍的生物有机肥中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 对新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069活化后，经扩大培养 后，制得活菌浓度为0 · 5X101Q~1 · 0X101Qcfu/ml的菌液； (2) 将步骤（1)制得的菌液与有机肥料按照体积质量比（40~50):1的比例混合均匀，体 积质量比单位:L/t，制得有效活菌数2~4X108cfu/g的生物有机肥。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的有机肥料为符合NY525标 准要求的有机肥料。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的活化的步骤如下： 将新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌株菌株接种到活化培 养基中进行活化培养24h，温度为28~30°C、搅拌转速为180~200r/min; 活化培养基每升组分如下： 根皮苷〇.96g、MgS〇4· 7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0。6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的扩大培养的步骤如下： 将活化后的新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069按体积百分比 2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度28~30°C、搅拌转速为180~220r/min的条件下， 进行发酵培养； 发酵培养基每升组分如下： 根皮苷〇.96g、MgS〇4· 7H20 0.2g、NH4H2P〇4lg、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0。
【专利摘要】本发明涉及一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用。一株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium？Subarcticum)AMCC100069，于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC？No.11163。本发明所述新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium？Subarcticum)AMCC100069对引起苹果连作障碍的根皮苷等酚酸类物质具有显著降解效果，对果树植株生长具有极显著的促进作用，并可有效缓解生产中苹果连作障碍问题。CGMCC No.1116320150731
【IPC分类】C05F11/08, C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105462885
【申请号】CN201510966625
【发明人】周波, 刘淼, 王芳, 张铭铄, 毛志泉, 束怀瑞
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月19日