一种检测双价肾综合征出血热灭活疫苗型特异性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种检测双价肾综合征出血热灭活疫苗型特异性的方法，进一步讲是 提供了一种利用双重巧光定量RT-PCR、采用新一代化qMan MGB探针技术，对双价肾综合征 出血热灭活疫苗进行分型鉴别的方法，属于生物制品质量控制技术领域。
【背景技术】
[0002] 肾综合征出血热化FRS)是一种由汉坦病毒化antavirus，HV)引起的，W晒齿类动 物为传播媒介的严重危害人类健康的自然疫源性传染病，主要临床症状为发热、全身出血 W及肾功能损害。该病历史悠久，流行范围广，发病率高，已成为一个全球性的公共卫生问 题。
[0003] HFRS是危害人类健康最严重的病毒性传染病之一。由于发病后无有效的治疗性药 物，因此预防接种成为控制该病的关键。在双价肾综合征出血热灭活疫苗的质量控制与评 价中常需要进行鉴别试验，传统的病毒性疫苗鉴别试验主要采用常规血清学方法。2010版 《中国药典》建立和增订了部分疫苗的专属性鉴别试验，改变了部分生物制品采用效力试验 替代鉴别试验的情况，使疫苗质量控制得到进一步完善。
[0004] 汉坦病毒传统的鉴别分型方法多采用交叉空斑减少中和试验(PRNT)JRNT是比较 经典的血清学分型方法，主要是通过衡量相应的中和抗体滴度来确定病毒的型别。该方法 的优点是稳定、结果可靠，因此一直沿用至今。但该方法也有一定的不足之处，比如操作繁 琐，耗时较长，影响因素较多等，因而正逐渐被新兴的分型方法所取代。双价肾综合征出血 热灭活疫苗的ELISA快速鉴别试验，虽然显示出了很好的特异性和稳定性。但由于病毒间抗 原性变异较大，因此有时仅凭个别株型特异性单克隆抗体很难准确分型。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种检测双价肾综合征出血热灭活疫苗型特异性的方法，通过双重 巧光定量RT-PCR对双价肾综合征出血热灭活疫苗进行分型鉴别，方法简便快速、特异性强 且灵敏度高，是公认的病原体快速检测金标准。
[0006] 本发明所述的一种检测双价肾综合征出血热灭活疫苗型特异性的双重巧光定量 RT-PCR方法，包括W下步骤：
[0007] 1)灭活出血热病毒的电镜观察
[0008] 2)引物和探针的设计
[0009] 共设计了4对引物和2条巧光探针，I型和Π 型各两对引物和一条探针。序列如下：
[0010] I型引物及探针序列：
[0011] HTNF1:5 '-CAGAGGGAAATCAATGCC-3 '
[0012] HTNR1：5'-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3'
[0013] HTNF2:5 '-TATGGAGGAACTACAGAGG-3 '
[0014] HTNR2:5'-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '
[0015] HTNP: 5 ' -FM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3 '
[0016] Π 型引物及探针序列：
[0017] 沈0F1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '
[0018] 沈0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '
[0019] 沈0F2:5 '-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3 '
[0020] 沈0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '
[00別]SE0P:5 '-肥X-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3 '
[0022] 3)灭活出血热病毒RNA的提取
[0023] S.lTRIzol法
[0024] 3.2试剂盒法
[0025] 4)阳性对照品的制备
[00%] 4.1目的片段的克隆
[0027] 4.1.1建立逆转录体系
[002引 4.1.3 PCR产物的回收
[0029] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的片 段，具体过程见试剂盒说明书。
[0030] 4.1.4重组质粒 PMD18-T/HTN 和 PMD18-T/SE0 的构建
[0031] 4.1.5 D册α感受态细胞的制备
[0032] 4.1.6重组质粒转化感受态细胞
[0033] 从一70°C冰箱中取出D册α感受态细胞冰浴融化。加入扣1重组质粒。冰浴30min。42 。(:热击1.5min。加入40化1 LB液体培养基，37°C，100巧m振荡培养约化。然后涂布于含有氨 节抗性的LB固体培养基上，37Γ倒置培养过夜。
[0034] 4.1.7重组质粒的大量制备
[00巧]从过夜培养的平皿上挑取单个菌落并接种于5ml LB液体培养基中。37°C，180巧m 振荡培养约化。待重组菌生长至对数期后，利用化KaRa Mini邸ST Plasmid化rification Kit按照操作说明提取质粒，并于一20°C保存。
[0036] 4.2目的片段的鉴定
[0037] 4.2.1 PCR 法鉴定
[003引分别W重组质粒PMD18-T/HTN和PMD18-T/SE0为模板，扩增体系如下：
[0039]
[0040] 反应条件同前。
[0041] 4.2.2酶切消化法鉴定
[0042] 选择EcoR I、Hind III两个酶切位点进行消化。其中，EcoR I酶切位点位于载体 456bp处，I型和Π 型重组质粒经EcoR I酶切后产生的片段分别为2 785bp和2 8"bpeHind III酶切位点位于载体399bp处，I型和Π 型重组质粒经化nd III和EcoR I双酶切后各产生 两条片段，I型重组质粒酶切产生的片段长度分别为15化P和2 63化ρ，Π 型重组质粒酶切产 生的片段长度分别为20化Ρ和2 63化Ρ。酶切反应体系如下：
[0043] (1化coR I单酶切反应体系，反应体系(2化1)如下：
[0044]
[0045] 混匀上述液体，37°C水浴化。[0046] (2化ind III和EcoR I双酶切反应体系，反应体系（2化1)如下：
[0047]
[004引
[0049] 混匀上述液体，37°C水浴化。
[0化0] 4.2.3测序鉴定
[0051] 将提取的质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。并使用BLAST将测序 结果与PS-6株和L99株的基因序列进行比对分析。
[0052] 5)双重巧光定量PCR反应体系和反应条件的确立
[0053] 反应总体积为20μ1，具体如下：
[0化4]
[0055]反应条件如下：
[0056] 预变性94Γ 2min变性94Γ 15s退火6(TClmin 40个循环 [0057]本发明的积极效果在于:提供了一种新的对双价肾综合征出血热灭活疫苗进行分 型鉴别的方法，利用双重巧光定量RT-PCR、采用新一代化qMan MGB探针技术，能够对国内现 有的双价肾综合征出血热灭活疫苗(沙鼠肾细胞）、双价肾综合征出血热灭活疫苗(地鼠肾 细胞）W及双价肾综合征出血热灭活疫苗(Vero细胞)进行分型鉴别，并且出血热病毒I型和 Π 型质粒检测的灵敏度分别达到4.68 X l〇icopies/yl和5 X l〇icopies/yl。该方法特异性 很好而且能够准确分型，可W将其用于双价肾综合征出血热灭活疫苗的分型鉴别。
【具体实施方式】
[005引通过W下实施例进一步举例描述本发明，并不W任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0化9] 实施例1:
[0060] 1.灭活出血热病毒的电镜观察
[0061] 利用负染法将灭活纯化的出血热病毒液制备成电镜标本并在透射电子显微镜下 观察。过程如下：将灭活出血热病毒悬液滴加到铜网上，室溫吸附数分钟，用滤纸吸干多余 的液体，2%醋酸轴负染1~2min后置于H-7650型透射电子显微镜下观察。
[0062] 2.引物和探针的设计
[0063] 汉坦病毒基因是分节段的单负链RNA，基因组分节段的特点使得病毒很容易发生 变异。因此，选择合适的扩增区域十分重要，即所选择的区域不仅要保守而且还应具备较好 的型特异性。核蛋白是病毒进化过程中相对保守的蛋白质，其编码基因也相对保守，且研究 发现病毒核蛋白中存在许多型特异性的抗原位点，因此本实验选择核蛋白编码基因所在的 S片段作为设计型特异性引物和探针的祀序列。根据GenBank中已公布的中国HFRS疫苗株及 其他国内流行株S片段基因序列，利用DNAMAN软件进行同源性比对分析，选出一段型内相对 保守且型间相对差异的区域作为扩增的祀区域。然后根据巧光定量PCR引物和探针的设计 原则，利用Primer P;rimie;r5.0和PrimerE邱ress3.0软件在祀序列的保守区设计各型特异 性的引物和探针，并利用BLAST进行在线比对分析，最终确定为出血热I型和Π 型特异的引 物和探针。
[0064] I型参考的毒株主要有Z10株，84FLi株，LR1株及A16株等；Π 型参考的毒株主要有 Z37株，L99株及R22株等。
[0065] 共设计了4对引物和2条巧光探针，I型和Π 型各两对引物和一条探针。序列如下：
[0066] I型引物及探针序列：
[0067] HTNF1:5 '-CAGAGGGAAATCAATGCC-3 '
[006引 HTNR1:5'-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3 '
[0069] HTNF2:5 '-TATGGAGGAACTACAGAGG-3 '
[0070] HTNR2:5'-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '
[0071 ] HTNP:5 '-FAM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3 '
[0072] Π 型引物及探针序列：
[0073] 沈OF1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '
[0074] 沈0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '
[00 巧]沈0F2:5，-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3 '
[0076] 沈0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '
[0077] SE0P:5 '-肥X-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3 '
[007引 3.灭活出血热病毒RNA的提取
[0079] 3.1试剂盒法
[0080] 按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书进行，过程如下：
[0081] (1)取20化1双价肾综合征出血热灭活疫苗液于1.5ml微量离屯、管中。
[0082] (2)加入20化1的Solution A，充分混合均匀后，室溫静置5min。
[0083] (3)加入75μ1 的Solution B，均匀混合后，12 000巧m离屯、5min。
[0084] (4)吸取步骤(3)中的离屯、上清并转移到新的2ml的Col lection化be中，加入25化 1含1%冰乙酸的异丙醇，上下翻转混匀。
[0085] (5)将Spin Column置于另一新的2ml的Collection Tube上并将(4)中的混合液转 移至Spin Column