检测小麦是否含有簇毛麦6vs染色体臂的成套试剂与分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的 成套试剂与分子标记。
【背景技术】
[0002] 簇毛麦D曰sypyrum villosum(L. )P.C曰nd曰rgy(syn.H曰yn曰Idi曰 villos曰 Schur)是 小麦族簇毛麦属的一个二倍体种，化=2x= 14。它起源于地中海的东北部，从南欧的法国南 部到里海，西南亚，俄罗斯和高加索地区(De化ce等1995;化eder化sen 1991)，是一种杂草 类植物，生长在恶劣、干旱的环境中（Agnieszka Gradzielewska,2006)。由于其颖壳脊上和 外釋顶端有丛生的毛状物，故名之。
[0003] 簇毛麦含有许多生物胁迫和非生物胁迫抗性基因及优质基因，是改良小麦的优良 基因源。Sears、Lukaszewski和刘大均等先后将簇毛麦基因组转移到小麦的遗传背景，育成 3套染色体附加系。根据簇毛麦来源的不同，Qi等（1998)首先将Sears培育的小麦-簇毛麦附 加系用DA1V#1-DA7V#1表示，将南京农业大学培育的小麦-簇毛麦附加用DA1V#2-DA7V#2表 示，Liu等(2011)随后将A.J丄ukaszewski培育的附加系用DA1V#3-DA7V#3表示，申请人将前 苏联簇毛麦No. 1026衍生的6VS染色体命名为6V#4S(Lin等，2013)。
[0004] 6V#1 S，6V#2S，6V#3S和6V#4S染色体臂的区别仅在于来源地不同。6V#1 S，6V#2S， 6V#3S和6V#4S染色体短臂来源不同对小麦白粉病抗性也表现不同。携带6V#1S和6V#3S染色 体的小麦不抗白粉病，而具有6V#2S和6V#4S染色体的小麦对白粉病均表现免疫化iu等， 2011)。
[0005] 陈佩度等（1995)利用6V#2(6A)异代换系与扬麦5号杂交，结合杂种后代的丫-射线 处理，成功选育出抗白粉病T6V#2S · 6AL易位系，其抗病基因命名为化21(Qi等，1996)。陈孝 等（1996)利用来自前苏联的簇毛麦No. 1026培育了硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH1，TH2和 TH3,及抗白粉病的6V#4(6D)代换系94622-1、94625-1、94632-1和94633-1，利用1'册与小麦 品种宛7107杂交、回交，未成熟胚培养及/花药培养等方法，培育出6V#4S · 6化染色体易位 系化97033、化97034和 Rii97035(Li 等，2005)。
[0006] 虽然6V#2S · 6AL易位系和6V#4S · 6化易位系对小麦条纹花叶病毒及其传媒载体- 小麦卷曲蛾的敏感性不同；在染色体水平上，2条外源染色体臂也与不同的小麦染色体建立 了连锁关系，但二者对白粉病菌所有小种表现免疫，故在白粉病抗性表型上难于相互区分。
[0007] 基于PCR扩增的分子标记是一种鉴定外源染色体的简便手段。目前为止，针对6V# 2S · 6AL易位系开发的特异PCR标记有如下7个。Qi等通过随机引物扩增法筛选的RAPD标记 0PH17;Liu等将该标记的扩增片段回收测序后转化为稳定的SCAR标记SCARi7〇o;Cao等 (2006)基于一个受白粉菌诱导表达的丝/苏氨酸蛋白激酶基因（Contigl7515)序列开发了 一个可同时扩增6VS/6AS/6BS/6DS的共显性标记NAU/xibaol5F和NAU/xibaol5R;畑en (2006)等利用抑制差减杂交获得一个在携带Pm21的抗病系中特异表达的富亮氨酸结构域 基因化-LRR2，将其转化为PCR标记，可特异扩增6VS和6AS;王春梅等(2006)对11个抗病基因 同源序列（RGA)和17对STS引物进行多态性分析，获得2个稳定的特异性分子标记 CINAU17-1086和CINAU18-723 ,可特异扩增6VS染色体臂。上述化0、化en和王春梅等开发的标 记均在聚丙締酷胺凝胶中分离。
[000引对6VMS ·抓L易位系，李辉等（2005)筛选了5个6VS染色体特异的RAPD分子标记， 其中OPAL03750仅能从携带6V#4S染色体臂的簇毛麦和小麦中扩增，成为区别于6V#2S · 6AL 的分子标记。申请人也开发了 1个可特异区别6V#2S · 6AL和6V#4S ·抓L的分子标记(张云龙 等，2012)。
[0009] 最近，Bie等（2015)筛选出一个可同时鉴定6V#2S/6V#4S/6AS/6DS的分子标记 MBH1。
[0010] 小麦白粉病是由活体营养白粉菌小麦专化型（Blumeria graminis forma specialis化itici)引起的一种世界性真菌病害，常造成小麦产量的严重损失。目前中国 多数大面积推广的小麦品种对白粉病的抗性较差，限制了其推广应用的范围和年限。因此， 选育高抗白粉病的小麦品种和改良目前推广优良小麦品种的白粉病抗性，是防治小麦白粉 病，实现小麦安全生产最安全、有效的措施。迄今为止，在小麦农家品种和野生近缘种中已 经发掘了多个白粉病抗性基因，并开发了一些抗病基因的分子标记。但白粉菌的生理小种 变异快，很多抗病基因在生产上使用不久就被新的小种所克服。抗白粉病是小麦育种的一 个长期而重要的内容。来自簇毛麦化aynaldia villosa)的6V#2S · 6AL和6V#4S · 6化易位 系因对小麦白粉病菌所有生理小种免疫，表现出一种广谱的抗性，目前已被广泛用于育种 计划。一些品种或品系的系谱中包含了 2个易位系，后代抗源的归属有待鉴定。另方面，由于 6V#2S和6V#4S染色体属于相同同源群，其抗性是否相同一直是个悬而未解的问题，获得特 异染色体臂上不同位点的遗传标记有助于对此开展深入的研究。因此，无论对于抗病育种 的辅助选择，还是对于理论研究，都迫切需要开发大量特异于目标染色体的分子标记。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是如何检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色 体臂。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦 6VS染色体臂的成套试剂，其名称为成套试剂1。所述成套试剂1由A-P与B-P、C-P、D-P和E-P 中的至少一种组成.
[OOU]所述A-P由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
[0014] 所述B-P由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
[0015] 所述C-P由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
[0016] 所述D-P由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
[0017] 所述E-P由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
[001引所述成套试剂1中的各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起;也可将其中的各 引物对单独包装。所述成套试剂1中各单链DNA的摩尔数比例可W根据实际检测的样品进行 调整，所述成套试剂1中各单链DNA的摩尔数也均可相同，所述成套试剂1中各引物对的摩尔 数也均可相同。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦遗传背景中是否含有 簇毛麦6VS染色体臂的引物对，该引物对为所述A-P。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS 染色体臂的成套试剂，其名称为成套试剂1-1。所述成套试剂1-1由所述成套试剂1或所述A- P与XI组成;所述XI为F-P、G-P和H-P中的至少一种；
[0021] 所述F-P由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
[0022] 所述G-P由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
[0023] 所述H-P由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成。
[0024] 所述成套试剂1-1中的各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起;也可将其中的 各引物对单独包装。所述成套试剂1-1中各单链DNA的摩尔数比例可W根据实际检测的样品 进行调整，所述成套试剂1-1中各单链DNA的摩尔数也均可相同，所述成套试剂1-1中各引物 对的摩尔数也均可相同。
[0025] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦遗传背景中是否含有 簇毛麦6VS染色体臂的系统。所述系统为系统A1、系统A2或系统A3;
[0026] 所述系统A1由所述成套试剂1与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
[0027] 所述系统A2由所述A-P与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
[0028] 所述系统A3由所述成套试剂1-1与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成。
[0029] 上述系统中，所述系统A1、所述系统A2和所述系统A3中的进行PCR扩增所需的试剂 均可为DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的试剂（如2x Taq MasterMix)。^ Taq MasterMix可为 北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0682A。所述系统Al、所述系统A2和所述系 统A3中的进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述PCR仪可为Bio-RAD T100? Thermal Cycler。
[0030] 为解决上述技术问题，本发明还提供了簇毛麦6VS分子标记。所述簇毛麦6VS分子 标记为分子标记al、分子标记日2或分子标记日3;
[0031] 所述分子标记al由A与B、C、D和E中的至少一种组成；
[0032] 所述A为序列17所示的DNA分子，该DNA分子为W簇毛麦基因组DNA为模板用所述A- P进行PCR扩增得到的DNA分子；
[0033] 所述B为序列18所示的DNA分子，该DNA分子为W簇毛麦基因组DNA为模板用所述B- P进行PCR扩增得到的DNA分子；
[0034] 所述C为序列19所示的DNA分子，该DNA分子为W簇毛麦基因组DNA为模板用所述C- P进行PCR扩增得到的DNA分子