一种壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及功能材料合成技术领域，尤其是涉及一种壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键 合硅胶固定相，本发明还涉及该固定相的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 高效液相色谱(HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于上世纪60年代后期引入了 气相色谱理论后迅速发展起来的。反相液相色谱(RPLC)是至今应用最广的色谱分离技术， 它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和 亲水性化合物却无法或很少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环 保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。但是由于实验条件的限制，很多极 性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了 NPLC的应用范围。
[0003] 壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，壳聚糖大分子中有 活泼的羟基和氨基，具有明显的亲水性，近年来被广泛的应用于亲水性色谱分离的研究，并 表现出优异的特性;离子液体是一类纯粹由离子构成的非分子物质，且功能化的离子液体 带有的各式各样的功能团可使其具有多种能力，如阴阳离子对之间的静电作用力，以及它 们与其他分子进行离子交换、氢键、:π-π堆积和疏水(亲水)作用的能力，因而离子液体在分 离分析中表现出高的选择性和无可比拟的可控分离模式，近年来已被广泛的用于色谱固定 相的修饰上；杯芳烃是由苯酚单元通过亚甲基在羟基的邻位桥连而形成的低聚物，具有三 维空腔和苯环骨架结构，能够与客体分子发生包结、吸附和等作用，独特的结构特点使 其具有良好的分子识别功能，在色谱领域将有良好的应用前景。
[0004] 根据这三种化合物的性质，研究人员设想把它们同时键合到硅胶上，以制备出性 能优异的液相色谱固定相。申请人单位的研究人员之前曾将壳聚糖(500Da)键合在硅胶表 面制备出了一个色谱柱，但是因为壳聚糖溶解性差，键合量低等原因主要表现为杯芳烃的 疏水作用，在疏水作用的模式下实现了对核苷、多环芳烃、单取代苯等很好的分离;但是从 亲水作用方面考察，发现其具有较弱的亲水性，分离效果极差，基本上达不到完全分离的要 求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的缺陷，提供一种能显著提高其亲水 色谱性能的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相，本发明同时提供该固定相的制备方 法和用途。
[0006] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相，其结构式为：
[0007] 本发明所述壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法为： 第一步，由壳聚糖（20 kDa)与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物通过取代反应得到3-(4-溴丁基)-1_甲基咪唑溴化物键联壳聚糖； 第二步，先通过对叔丁基苯酚与甲醛在碱性条件下缩聚反应制得对叔丁基杯[4 ]芳烃， 之后对叔丁基杯[4]芳烃与1，3-二溴丙烷通过取代反应得到5，11，17，23-四叔丁基-25，27-二(3-溴丙氧基)-26，28-二羟基杯[4 ]芳烃； 第三步，通过戊二醛对硅胶表面进行改性后与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键联 壳聚糖进行缩合反应，之后采用硼氢化钠还原，得到的产物再与5，11，17,23_四叔丁基-25， 27-二(3-溴丙氧基)-26,28_二羟基杯[4]芳烃反应，得到预期固定相成品。
[0008] 本发明制备的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相作为高效液体色谱分离材 料的用途。
[0009] 本发明的优点体现在以下几点： (1)本发明采用离子液体改性大分子聚合壳聚糖，不仅充分利用离子液体对阴阳离子 对之间的静电作用力，以及它们与其他分子进行离子交换、静电作用、氢键、:π-π堆积和疏水 (亲水)作用的能力，同时改善了大分子量壳聚糖溶解度低，键合量低的缺点，显著的提高了 壳聚糖的键合量，并引进大量的羟基和氨基，提高了固定相的亲水性能。
[0010] (2)本发明制备的固定相具有HILIC/RPLC混合分离模式，即在高有机相比例下具 有典型的亲水色谱特点，适用于极性和弱极性物质的分离分析，同时在高水比例下呈现疏 水模式，可用于分离非极性和弱极性化合物。
[0011] (3)本发明制备的固定相兼具壳聚糖、杯芳烃、离子液体类固定相的优点，大分子 量，高键合量极大地增加了固定相的羟基和正负电荷作用位点，可与溶质发生亲水作用，疏 水作用、离子交换、氢键、静电作用等，作用位点丰富，具有很好的分离选择性。
[0012] (4)本发明的固定相以高比例的乙腈流动相进行分离，既避免了使用正向色谱需 要用到的强毒性有机试剂，同时可实现串联质谱时高的离子化效率问题，适用于核苷、磺 胺、杂环胺、黄酮等的分离分析。
[0013] (5)本发明固定相制备方法简单，既引入了离子液体这种带电基团，同时通过离子 液体的改性，显著提高了壳聚糖的溶解度，可以使较大分子量的壳聚糖(200000Da)成功的 键合在硅胶表面，应用广泛，重现性好，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明固定相的结构式。
[0015] 图2是本发明固定相的反应式。
[0016] 图3是本发明固定相的红外光谱图。
[0017] 图4是本发明固定相的热重分析图。
[0018] 图5是本发明固定相在HILIC模式下分离五中核苷色谱图。
[0019]图6是本发明固定相改性之前CCS4的亲水分离五种核苷色谱图。
[0020]图7是本发明固定相在HILIC模式下对四种杂环胺类的分离图。
[0021]图8本发明固定相在HILIC模式下对七种磺胺的分离图。
[0022]图9是本发明固定相在HILIC模式下对三种同分异构体酚类的分离图。
[0023]图10是本发明固定相在HILIC模式下对四种黄酮的分离图。
[0024]图11是本发明固定相随流动相中水含量变化保留因子变化图。
[0025]图12是本发明固定相疏水/亲水混合模式U型图。
【具体实施方式】
[0026] 如图1所示，本发明所述的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的结构式为：
[0027] -、本发明壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相可通过如图2所示的制备方法 得到： 该固定相的合成过程大致可分为三个过程:第一部分即离子液体键连壳聚糖的合成： 由壳聚糖（20 kDa)与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物通过取代反应得到3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键联壳聚糖（I);第二部分主要是5，11，17，23-四叔丁基-25，27-二(3-溴 丙氧基)-26,28_二羟基杯[4]芳烃（Π )的制备:先通过对叔丁基苯酚与甲醛在碱性条件下 缩聚反应制得对叔丁基杯[4]芳烃，之后对叔丁基杯[4]芳烃与1，3_二溴丙烷通过取代反应 得到5，11，17，23-四叔丁基-25，27-二(3-溴丙氧基)-26，28-二羟基杯[4]芳烃（Π );第三部 分注意是通过戊二醛对硅胶表面进行改性后与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键联壳聚 糖进行缩合反应，之后采用硼氢化钠还原，得到的产物再与5,11，17,23_四叔丁基-25,27-二(3-溴丙氧基)-26,28-二羟基杯[4]芳烃（Π)反应，即得到预期固定相(3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键连壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相)成品。
[0028] 二、本发明壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的具体制备方法为： 1)离子液体键连壳聚糖的制备(I):在氮气气氛下制备3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化 物键联壳聚糖。将1.0 g(6.21mmol)壳聚糖（20 kDa)、3-(4-溴丁基）-1-甲基咪唑溴化物 (IL，8.32mmol)、1.65 g去离子水和15 ml异丙醇加入到50 ml三口圆底烧瓶中，75 °C条件 下磁力搅拌反应40 h，得浑浊体系，用乙醇沉淀反应混合物，过滤得固体物质，将其用无水 乙醇索式提取纯化至无离子液体，真空40°C干燥24 h。
[0029] )对叔丁基杯[4]芳烃的制备:称取32 g对叔丁基苯酚于1000 mL三口烧瓶中，加入 20 mL36%甲醛，将0.408 g NaOH于2 mL水中溶解后加入，开始搅拌，并缓慢升温；当温度升 至100 °C左右，反应1 h，通入N2，待液体产生大量泡沫并凝固后停止搅拌，去N2，冷却；加入 200 mL温热的二苯醚，搅拌，加热，通入N2,此时温度达到200°C以上，反应液剧烈沸腾，待反 应平稳后去N 2,反应3 h，停止加热和搅拌，冷却；加入200 mL乙酸乙酯，搅拌30 min后停止， 静置2 h，抽滤，依次用乙酸乙酯、冰乙酸、水、丙酮洗涤。
[0030] )5，11，17，23-四叔丁基-25，27-二(3-溴丙氧基)-26，28-二羟基杯[4]芳烃（Π )的 制备:称取3.24 g (5 mmol)对叔丁基杯[4]芳经、5.2 mL(50 mmol)l，3_二溴丙烷、1.66 g (12 mmol) K2CO3于250 mL圆底烧瓶中，加入125 mL无水乙腈，在氮气保护下回流48 h;蒸出 溶剂和未反应的二溴化物，残渣用25 mL5%盐酸和50 mL氯仿洗涤，萃取分液后，无水Mg2S〇4 干燥，抽滤，将滤液旋转蒸发至干;在硅胶Η装填的色谱柱中分离，以二氯甲烷和石油醚作为 洗脱剂(体积比1:1 )，收集第二个色带。
[0031] 3)硅胶的活化:称取20g特制多孔硅胶(粒径5 μπι，孔径100 Α，比表面积300 m2/g) 浸入500 mL HC1/H20(其中HC1 : H20的体积比为1: 3)中浸泡24 h，然后机械搅拌下回流 10 h除去金属离子，再用G5砂芯漏斗过滤，用二次重蒸水反复洗至中性，在160°C条件下干 燥10 h脱去表面水，即得活化硅胶，储于干燥器中备用。
[0032] )氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶（ΙΠ )的制备：取24 mL氨丙基