三乙氧基硅烷、新蒸 无水甲苯240 mL于500 mL三口瓶中，搅拌下加入18 g活化硅胶，氮气保护下回流8 h。反应 结束后，用G5砂芯漏斗抽滤，依次用甲苯，丙酮，二次重蒸水，丙酮各洗涤三次，80°C条件下 真空干燥24 h，得到氨丙基三乙氧基键合硅胶。
[0033])戊二醛改性硅胶（IV)的制备：取150 mL 5%的戊二醛溶液，用0.05 mol/L的磷酸 钾溶液调节其pH=7,再加入3.5 g胺丙基硅胶，在25°C下反应3 h;用G5砂芯漏斗过滤，并用 蒸馏水反复洗涤。
[0034] )离子液体键连壳聚糖键合改性硅胶（V)的制备:称取0.9 g离子液体键连壳聚糖 于150 mL圆底烧瓶中，加入80 mL蒸馏水，搅拌至完全溶解，加入上步中的产物IV，冷井中控 制4°C反应24 h，将所得产物用蒸馏水洗涤抽滤，置于小烧杯中；磁力搅拌下缓慢加入10 mL 5 mol/L的NaBH4,反应一夜，用水洗涤、抽滤，在60°C条件下真空干燥。
[0035] )3-(4-溴丁基)-1_甲基咪唑溴化物键连壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相 (VI)的制备:称取0.7 g产物Π 、加入步骤6的产物V、0.25 g K2C03于150 mL圆底烧瓶中，加 入75 mL无水乙腈，在氮气保护下回流48 h;所得产物抽滤，分别用25 mL5%盐酸和50 mL氯 仿洗涤后，得到3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键连壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固 定相(ILCCS4)。
[0036] 三、本发明离子液体键连壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的分析表征： 1、红外分析结果 如图3所示，离子液体键连壳聚糖键合改性硅胶（V )红外光谱的特征吸收峰与3-(4-溴 丁基)-1-甲基咪唑溴化物键连壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相(VI)部分吸收峰基 本一致，而且与戊二醛改性硅胶αν)显著不同，从而可以说明3 -(4 -溴化丁基)-1 -甲基 咪唑溴化壳聚糖（ILC)成功的键合到了硅胶表面。除此之外，还可以看到化合物VI在1449， 1518，and 1576 cm-1位置出现了苯环的特征吸收峰，由此可以说明5,11，17,23-四叔丁 基-25，27-二(3-溴丙氧基)-26，28-二羟基杯[4]芳烃同样也成功的键合到了硅胶表面。 [0037] 2、元素分析结果 利用元素分析可以证明每一步都成功实现了反应，如下表1所示:产物m含有N，而硅胶 本身不含N，证明氨丙基三乙氧基硅烷成功键合到硅胶上;戊二醛含有C、H、0三种元素，产物 IV较m含碳量增高，含N量降低，说明反应成功;壳聚糖含有大量的N元素，产物V含N量较IV 增加，说明键合成功;杯芳烃由C、H、0三种元素组成，产物VI含C量增加，说明得到了目标产 物。
[0038] 表1元素分析结果
3、热重分析结果 如图4所示，从ILCCS4的热重分析结果可以看到，ILCCS4的失重温度约在350°C，由此 说明本发明制备的ILCCS4具有较高的热力学和化学稳定性。
[0039] 四、本发明的固定相用作高效液相色谱的分离填充料 1、色谱柱的装填 本发明制备的固定相以四氯化碳作为匀浆液，乙腈作为顶替液，装柱压力为45 MPa，将 固定相装入150X4.6 mm i.d.清洗干净的不锈钢管柱中，半小时后，缓慢地降压，停栗。将 填满填料的柱子装上滤片和柱接头，标上柱方向、填料、柱尺寸和装柱日期。在〇. 2至1 mL/ m i η的逐渐升高的流速下用乙腈冲洗一天，使用前再用流动相平衡。
[0040] 对不同种类化合物的分离 以乙腈-水为流动相，成功实现了对结构近似、分离难度大的物质的分离，如核苷、黄 酮、磺胺、酚类、杂环胺等。
[0041 ]图5、图6为五种核苷分别在ILCCS4与CCS4(壳聚糖分子量小且没有离子液体改性 前)上分离情况对比，说明本发明的固定相在作用模式和效果上与之前的CSS4存在完全不 同的作用机理和效果。色谱分离条件:流动相为乙腈:水=90:10,流速为0.8mL/min，检测波 长为254nm，柱温为30°C。色谱峰：1、4,6_二氯嘧啶，2、尿嘧啶，3、2_氨基-6-氯嘌呤，4、鸟嘌 呤，5、无环鸟苷。从图5、图6可以看出，在亲水模式下，5种核苷在ILCCS4上可以实现很好的 完全分离，而在CCS4上完全没有分开，这可能是由于离子液体改性壳聚糖显著提高了固定 相(ILCCS4)上的羟基作用位点，同时与离子液体相结合，使得氢键作用，离子交换作用和静 电作用表现的更加明显，分析效果更加优异。
[0042]图7为本发明固定相对四种杂环胺类的分离。色谱分离条件:流动相为乙腈：甲醇： 水=92:4:4，流速为lmL/min，检测波长为250nm，柱温为30 °C。色谱峰：1、β_咔啉1-甲基-9H- P比啶[3，4_b ]吲噪（Harman)，2、9H-吡啶[3，4_b ]吲噪（Noharman)，3、2-氨基-3-甲基-9H-P比 啶并[2，3-b]吲哚(MeAaC)，4、2-氨基-1 -甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-b]吡啶(PHIP)。
[0043] 在本发明固定相上实现了 Harman和Noharman的分离，这是在疏水作用模式下C18 柱不能实现的，这可能是在亲水作用模式下，Harman和Noharman之间存在的微弱的极性差 异受固定相离子交换和者静电作用的影响，实现了基线分离。
[0044]图8为本发明固定相对七种磺胺的分离图。色谱分离条件:流动相为乙腈:水=88: 12,流速为1 mL/min，检测波长为270nm，柱温为30°C。色谱峰：1、磺胺嘧啶，2、磺胺二甲基嘧 啶，3、磺胺甲基嘧啶，4、磺胺邻二甲氧嘧啶，5、磺胺间二甲氧嘧啶，6、磺胺二甲异嘧啶7、 磺胺-6-甲氧嘧啶。在亲水模式下，其中磺胺可以实现完全的基线分离，满足分析需求。 [0045]图9是本发明固定相对三种酚类的分离。色谱分离条件:流动相为乙腈:水=90:10， 流速为0.8mL/min，检测波长为400nm，柱温为30°C。色谱峰：1、间硝基苯酚，2、邻硝基苯酚， 3、对硝基苯酚。由此说明，ILCCS4在亲水模式下可以实现对同分异构的分离。
[0046]图10是本发明固定相对四种黄酮的分离。色谱分离条件:流动相为乙腈：水=80: 20，流速为1111171^11，检测波长为254腦，柱温为30°(：。色谱峰：1、桔皮素，2、淫羊藿苷，3、柚 皮素苷二氢查尔酮，4、5,7_二羟基黄酮。从图10可以看出，在亲水模式下，ILCCS4可以实现 四种黄酮的完全分离。
[0047]、亲水模式 为了进一步研究本发明合成的固定相的色谱性能，本申请的发明人团队考察了不同流 动相条件下ILCCS4的色谱保留行为。首先，以磺胺为基质，考察了流动相中水体积从5%~ 20%变化时In k与CB的关系(k即保留因子，CB即流动相中水的体积分数）由图11可以看 出，随着流动相中水体积分数的增加，保留因子显著降低，这是典型的亲水色谱保留特征， 由此可以说明ILCCS4具有典型的亲水色谱保留行为。
[0048]、疏水/亲水混合模式 同时，本申请的发明人团队还采用一系列中等偏极性的化合物对RPLC/HILIC混合模式 的保留行为进行了研究。如图12所示，ILCCS4固定相对这类化合物呈现了RPLC/HILIC混 合模式所特有的U型保留模式。在乙腈含量小于40%之前，随着乙腈含量的增加保留时间减 小，色谱保留模式呈现疏水模式;但是当乙腈含量大于80%之后，随着乙腈含量的增加，保 留时间反而增大，色谱柱呈现亲水模式。乙腈含量60%保留最弱，成为亲水/疏水两种模式 的分界线。由此说明除了亲水模式，本发明固定相还具有弱的疏水作用，这种混合模式的分 离可以在实际样品的分离中提供更有效的选择。
【主权项】
1. 一种壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相，其结构式为：2. 权利要求1所述的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相的制备方法，其特征在 于:包括下述步骤： 第一步，由壳聚糖与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物通过取代反应得到3-(4-溴丁 基)-1-甲基咪唑溴化物键联壳聚糖； 第二步，先通过对叔丁基苯酚与甲醛在碱性条件下缩聚反应制得对叔丁基杯[4]芳烃， 之后对叔丁基杯[4]芳烃与1，3-二溴丙烷通过取代反应得到5，11，17，23-四叔丁基-25，27-二(3-溴丙氧基)-26，28-二羟基杯[4 ]芳烃； 第三步，通过戊二醛对硅胶表面进行改性后与3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴化物键联 壳聚糖进行缩合反应，之后采用硼氢化钠还原，得到的产物再与5，11，17,23_四叔丁基-25， 27-二(3-溴丙氧基)-26,28_二羟基杯[4]芳烃反应，得到预期固定相成品。3. 权利要求1所述的壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相作为高效液体色谱分离 材料的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖衍生化杯[4]芳烃键合硅胶固定相：首先由壳聚糖与3-（4-溴丁基）-1-甲基咪唑溴化物反应得到3-（4-溴丁基）-1-甲基咪唑溴化物键联壳聚糖；通过对叔丁基苯酚与甲醛缩聚反应制得对叔丁基杯[4]芳烃，对叔丁基杯[4]芳烃与1,3-二溴丙烷通过取代反应得到5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二(3-溴丙氧基)-26,28-二羟基杯[4]芳烃；通过戊二醛对硅胶表面进行改性后与3-（4-溴丁基）-1-甲基咪唑溴化物键联壳聚糖进行缩合反应，之后采用硼氢化钠还原，产物再与5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二(3-溴丙氧基)-26,28-二羟基杯[4]芳烃反应，得到预期固定相。本发明固定相制备方法简单，应用广泛，重现性好，具有很好的应用前景。
【IPC分类】C08B37/08, B01J20/286, B01J20/30, C08G83/00
【公开号】CN105601940
【申请号】CN201610007587
【发明人】张文芬, 张岩皓, 蒋琼, 吴宁鹏, 杜慧芳, 班付国, 张书胜
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月7日