中看出，siRNAl可以将EDIL3表达抑制掉60%以上；siRNA2可以将EDIL3表达 抑制到30%左右，siRNA3可以将EDIL3抑制掉20%左右。
[0041] 因此，本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制EDIL3表达效果最显著的siRNAl进 行进一步的实验。
[0042] 实施例2:细胞转染
[0043] (1)转染前1天，收集对数生长期细胞，接种于12孔板内，接种数量约为5 X 104个细 胞，加入lmL培养基。
[0044] (2)100yL Opti-MEM培养基内加入4yL脂质体转染试剂，轻轻吹打，室温静置5min。
[0045] (3)100yL Opti-MEM培养基内加入60Nm,柔和混匀。
[0046] (4)混合转染试剂和s iRNA稀释液，轻轻吹匀，室温静置20min。
[0047] (5)转染后8h换液，继续培养48h后，进行转染后其它操作。
[0048] 实施例3:实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测脐静脉血管内皮细胞中 EDIL3的mRNA和蛋白表达
[0049] 具体过程如下：
[0050] 1 ·实时荧光定量RT-PCR
[0051 ] (1)总RNA提取:收集细胞至1.5mL无 RNA酶离心管中，加入0.5mLTrizol，在冰上充 分混匀吹打，静置1 Omin。加入0.125mL氯仿，剧烈振荡20s，冰上静置5min。4 °C离心，12000r/ min X 15min，吸取0.2mL上清至另一个1.5mL，进而加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，冰 上静置1〇111；[11。4 <€离心，120001'/111；[11\15111；[11，弃上清，加入11111^预冷的75%乙醇，轻轻洗涤沉 淀，4°C离心，12000以11^11\151^11。弃上清，晾干，溶于2(^0^?(：水中。多功能酶标仪测定提 取RNA的浓度和纯度。
[0052] (2)反转录:利用takara反转录试剂盒将抽提的总RNA反转录为cDNA，反应体系如 下，
[0053]
[0054] Rnase Free dH20 up to lO^iL
[0055] 混勾后离心，37°C 15min，85°C5sec。
[0056] (3)荧光定量RT-PCR:利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体 系如下，
[0057]
[0058] 利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95°C预变性2min，进入40个PCR循 环，95°C5s，60°C30s。
[0059] 2.蛋白免疫印迹。
[0060] (1 )HUVECs总蛋白用改进的蛋白裂解液提取。
[00611 (2) 30ug蛋白加到12.5 %浓度的蛋白胶中电泳，并用电转仪转到PVDF膜上。
[0062] (3)蛋白的非特异性位点用脱脂牛奶封闭后用一抗封闭，4°C过夜，然后用TBST缓 冲液洗三遍。
[0063] (4)然后用HRP标记二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。
[0064] (5)最后，利用显色液显色并拍照分析。
[0065] 3.结果
[0066] 如图1所示，EDIL3的siRNA可以明显抑制EDIL3的mRNA及蛋白表达。
[0067] 实施例4: CCK-8方法检测细胞增殖
[0068] (1)收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。
[0069] (2)细胞过夜贴壁后，利用脂质体转染试剂介导转染，换液后48h检测细胞增殖情 况。
[0070] (3)吸弃原有培养基，每孔加入含10yL CCK-8的新鲜培养基110yL，培养3h后用多 功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。
[0071] (4)实验重复3次，结果如图2所示，EDIL3干扰后细胞增殖能力较阴性对照组及空 白对照组明显降低。
[0072] 实施例5:细胞迀移实验
[0073] (1)细胞迀移实验是利用孔径为8μΜ的transwell小室实施的。
[0074] (2)将转染siRNA 48h后的细胞消化重悬，接种IX 105细胞于transwell小室的上 室，培养基的血清浓度为〇. 5 %。
[0075] (3)下室加入700yL含1%血清浓度的培养基。
[0076] (4)在孵箱孵育12h后弃去培养基，将小室用多聚甲醛固定20分钟。
[0077] (5)将上室膜上层的细胞用棉签擦去，继而用结晶紫对细胞进行染色15分钟。
[0078] (6)迀移至膜下层的细胞用倒置显微镜观察并拍照分析。
[0079] (7)结果如图3所示，EDIL3干扰后细胞迀移能力较阴性对照组及空白对照组明显 降低。
[0080] 实施例6:细胞管样形成实验
[0081] (1)用无血清培养基将基质胶稀释至浓度为5mg/mL并混匀，将50uL稀释好的基质 胶加入96孔板孔中，在37°C孵箱中孵育40分钟使基质胶变为固态。
[0082] (2)将转染siRNA48h后的细胞消化重悬，将含4X104细胞的100yL培养基加入铺有 基质胶的96孔板中并孵育3小时。
[0083] (3)管样形成的结构用倒置显微镜观察并拍照分析。
[0084] (4)结果如图4所示，EDIL3干扰后细胞管样形成能力较阴性对照组及空白对照组 明显降低。
[0085]实施例7 :EDIL3的siRNA抑制晶状体上皮细胞增殖
[0086]材料:细胞为SRA01/04细胞系，用含10 %血清的DMEM培养基培养;CCK8试剂购自碧 云天生物科技有限公司。
[0087]方法:CCK8方法检测增殖
[0088] (1)收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。
[0089] (2)细胞过夜贴壁后，利用脂质体转染试剂介导转染，换液后48h检测细胞增殖情 况。
[0090] (3)吸弃原有培养基，每孔加入含10yL CCK-8的新鲜培养基110yL，培养3h后用多 功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。
[0091] (4)实验重复3次，结果如图5所示，EDIL3干扰后细胞增殖能力较阴性对照组及空 白对照组明显降低。
[0092] 结果:EDIL3干扰后，SRA01/04细胞EDIL3表达明显降低，其增殖能力明显降低（图 5)〇
[0093]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种抑制人EDIL3的干扰序列，其特征在于，包括正义链和反义链，所述的正义链如 SEQIDN0:1所示，反义链如SEQIDN0:2所示。2. -种如权利要求1所述的抑制人EDIL3的干扰序列在制备人EDIL3抑制剂中的应用。3. -种如权利要求1所述的抑制人EDIL3的干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物 中的应用。4. 根据权利要求3所述的抑制人EDIL3的干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物中 的应用，其特征在于，所述的抑制人EDIL3的干扰序列抑制血管内皮细胞的增殖、迀移、管样 形成。5. 根据权利要求3所述的抑制人EDIL3的干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物中 的应用，其特征在于，所述的新生血管性疾病是炎症性疾病、肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风 湿性关节炎或肺动脉高压。6. -种重组载体，其特征在于，所述的重组载体中包含如权利要求1所述的抑制人 EDIL3的干扰序列。7. -种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包含如权利要求1所述的抑制人 EDIL3的干扰序列，以及药学上可接受的载体。8. -种如权利要求6所述的重组载体、或一种如权利要求7所述的药物组合物在制备人 EDIL3抑制剂中的应用。9. 一种如权利要求6所述的重组载体、或一种如权利要求7所述的药物组合物在制备治 疗新生血管性疾病药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种特异性抑制人EDIL3的干扰序列，正义链如SEQ？ID？NO:1所示，反义链如SEQ？ID？NO:2所示。本发明还提供上述干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。本发明的针对EDIL3基因表达的干扰序列，可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞；本发明干扰序列可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制EDIL3表达的、治疗新生血管性疾病的生物靶向制剂或药物。
【IPC分类】A61K48/00, C12N15/113, C12N15/63, A61P9/10, A61K31/713, A61P35/00, A61P27/02
【公开号】CN105624159
【申请号】CN201610096846
【发明人】沈玮, 仲明, 秦海峰, 吴晋晖, 徐庆强, 宋洪元, 张睿
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月22日