度（18°C，28°C及37°C)下进行诱导培养，诱导表达结果如图2所示。结果显示， 低溫有助于金针茹草酸脱簇酶的可溶活性表达。
[0082] 将融合有助溶标签的阳T-22b-12E-0XDC与不含助溶标签的祀T-22b-0XDC质粒，分 别转化含有pGro7分子伴侣的化2UDE3)菌种，37°C下进行诱导培养，诱导表达结果如图3所 示。结果显示，融合助溶标签可明显提高金针茹OXDC的可溶性表达。
[0083] (6)酶性质分析
[0084] 将重组表达的OXDC进行色谱柱纯化后，测定酶的比活力及活力抑范围及最适抑范 围。表11所示为其中几种不同来源的重组OXDC酶性质结果：
[00化]表11.重组表达OXDC酶性质分析 「nORAl
[0087] 注:表中最适pH是指待筛选产酶菌的粗酶液在该pH值下活力最大。
[0088] 实施例4:草酸降解酶用于降解食物中的草酸(盐）
[0089] 此实施例仅W饥Ol的OXDC为例，研究草酸脱簇酶用于降解日常食物中的草酸，审U 备低草酸食品。
[0090] (1)降解茶水中的草酸(盐）
[0091] 分别称取毛尖，绿茶，红茶，普巧各5g，加入50ml去离子水，开水慢煮约15min，滤纸 过滤去掉茶叶残渣，得到茶水样品。降溫至室溫后立即检测或放4°C待测。
[0092] 将茶水样品中加巧樣酸调节至抑2.8，加入本产品至1〇111旨/100〇1111茶水，揽匀后于 室溫(25°C)反应30min。
[0093] 取处理前、后茶水样品，分别用HPLC方法检测样品中的草酸含量，评估本产品对茶 水中草酸的降解效果。
[0094] (2)降解咖啡中的草酸(盐）
[00M]分别称取市售蓝山咖啡及意式咖啡豆各5g，加入250ml去离子水，开水慢煮约 60min，滤纸过滤去掉茶叶残渣，得到咖啡浓缩样品。降溫至室溫后立即检测或放4°C待测。
[0096] 将咖啡样品中加盐酸调节至pH 2.4，加入本产品至1〇111邑/100〇1111咖啡液，揽匀后于 室溫(25°C)反应30min。
[0097] 取处理前，后咖啡样品，分别用HPLC方法检测样品中的草酸含量，评估本产品对咖 啡中草酸的降解效果。
[0098] (3)去除果汁中的草酸(盐）
[0099] 分别称取市售相橘，红布林，芹菜及宽菜等各100g果肉，棒汁机棒取果汁，滤纸过 滤去掉残渣，得到果汁浓缩样品。降溫至室溫后立即检测或放4°C待测。
[0100] 将果汁样品中加盐酸调节至抑2.0,加入本产品至lOmg/lOOOml果汁，揽匀后于室 溫（25°C)反应 30min。
[0101] 取处理前，后果汁样品，分别用HPLC方法检测样品中的草酸含量，评估本产品对果 汁中草酸的降解效果。
[0102] (4)去除燕麦粥中的草酸(盐）
[0103] 别称取市售燕麦片30g，加水200ml，加热煮沸约5min，呈粥状，降溫至室溫后立即 检测或放4 °C待测。
[0104] 将燕麦粥样品中加盐酸调节至pH 1.8,加入本产品至lOmg/lOOOg燕麦粥，揽匀后 于室溫(25°C)反应30min。
[0105] 取处理前，后燕麦粥样品，经1000 Og高速离屯、，取上清用滤纸过滤，为待测样品，分 别用HPLC方法检测样品中的草酸含量，评估本产品对燕麦中草酸的降解效果。
[0106] 结果如图4所示，柱形图中同一食物左侧的柱高表示处理前，右侧的柱高表示处理 后。
[0107] 实施例5:草酸降解酶用于食源性高草酸尿症的治疗
[0108] 6只比格犬，雄性，体重7~8kg，购买自湖北安陆瑞科森实验动物有限公司，饲养于 标准独立犬笼中，适应3~5天后，饲喂配制的无草酸食物(表12,不加草酸），收集2地尿液， 测定尿草酸总量及尿肌酢总量，W尿草酸/尿肌酢衡量尿草酸排泄量，待比值稳定后记为低 草酸排泄量(Basal),然后喂食高草酸食物(表12)，收集尿液，测定尿草酸排泄量，待稳定 后，取均值记为高草酸排泄量化OD)，然后在喂食高草酸食物的同时，喂食IOmg重组表达的 OXDC酶，收集尿液，测定尿草酸排泄量，测试不同来源的OXDC酶降解食物中草酸的能力，结 果如图5所示。结果表明，OXDC可W显著降解饮食中的草酸，减少草酸吸收，从而降低尿液中 的草酸排泄量，治疗食源性高草酸尿症。
[0109] 表12.犬粮配方 「rn ^ n1
LU111J 上所还买施例仪是刃充分化巧本巧巧化所苹的较佳的买施例，本巧巧的化护化 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围W权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种草酸脱羧酶，其特征在于：为通过大肠杆菌表达系统进行重组表达，并在PH< 3.0时稳定且有活力;表达过程中该草酸脱羧酶的蛋白序列较原生酶蛋白序列缺失信号肽 片段。2. -种可食用组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的草酸脱羧酶，用于预防和/或 治疗原发性高草酸尿症、II型高草酸尿症、肠源性高草酸尿症及含草酸钙泌尿结石疾病中 的一种或多种。3. 根据权利要求2所述的可食用组合物，其特征在于，为药物组合物、保健食品或特殊 医学用途配方食品。4. 一种食品添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的草酸脱羧酶，用于制备低草酸/ 无草酸的食品或饮料。5. -种草酸脱羧酶的重组表达方法，适用于PH<3.0时仍有活力的草酸脱羧酶的表达 生产，其特征在于，将优化后草酸脱羧酶编码基因的DNA片段与大肠杆菌表达载体按照3~ 9:1的摩尔比混合进行连接，构建重组表达载体，重组表达载体转化DH5a感受态细胞;通过 PCR及测序验证来筛选构建成功的重组表达载体转化菌，培养后抽取重组表达载体，转化含 有分子伴侣的大肠杆菌表达菌株，进行15~30 °C的低温培养并诱导蛋白表达。6. 根据权利要求5所述的草酸脱羧酶的重组表达方法，其特征在于，所述的优化包括删 除草酸脱羧酶编码基因 DNA片段的信号肽片段;或删除草酸脱羧酶编码基因 DNA片段的信号 肽片段并在C端融合助溶标签;或删除草酸脱羧酶编码基因 DNA片段的信号肽片段并在C端 融合助溶标签以及进行密码子优化;或对草酸脱羧酶编码基因 DNA片段进行密码子优化和 删除信号肽片段。7. 根据权利要求6所述的草酸脱羧酶的重组表达方法，其特征在于，所述助溶标签为多 聚谷氨酸片段，多聚天冬氨酸片段，多聚赖氨酸片段，多聚谷氨酰胺片段和多聚天冬酰胺片 段中的任意一种，或者由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和谷氨酰胺五种氨基酸随机 组合的片段。8. 根据权利要求5所述的草酸脱羧酶的重组表达方法，其特征在于，所述表达载体为乳 糖诱导表达载体、半乳糖诱导表达载体、IPTG诱导表达载体、热诱导表达载体或者冷诱导表 达载体。9. 根据权利要求5所述的草酸脱羧酶的重组表达方法，其特征在于，所述大肠杆菌表达 菌株为BL21、BL21(DE3)、K12、K12(DE3)、Origami、Origami(DE3)、OrigamiB、OrigamiB (DE3)、Rosetta或Rosetta(DE3)。10. 根据权利要求5所述的草酸脱羧酶的重组表达方法，其特征在于，所述的分子伴侣 为口6-1(邛8、？6仰7、？1(邛7、？6了€2和?了打6中的任意一种或者几种。11. 根据权利要求1所述的草酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1~11任 一所示。
【专利摘要】本发明公开了一种草酸脱羧酶及草酸脱羧酶的重组表达方法，该草酸脱羧酶为通过大肠杆菌表达系统进行重组表达，并在pH＜3.0时稳定且有活力；表达过程中该草酸脱羧酶的蛋白序列较原生酶蛋白序列缺失信号肽片段。重组表达方法适用于pH低于3.0时仍有活力的草酸脱羧酶，是将优化后草酸脱羧酶编码基因的DNA片段与大肠杆菌表达载体按照3～9:1的摩尔比混合进行连接，构建重组表达载体，重组表达载体转化DH5a感受态细胞；通过PCR及测序验证来筛选构建成功的重组表达载体转化菌，培养后抽取重组表达载体，转化含有分子伴侣的大肠杆菌表达菌株，15～30℃培养并诱导蛋白表达。提高了表达效率，简化生产步骤，降低生产成本。
【IPC分类】A23L33/10, C12N9/88, A61P13/00, C12N15/70, A61P13/04, A61K38/51
【公开号】CN105695441
【申请号】CN201610217032
【发明人】刘海峰, 吴玉峰, 宋保平
【申请人】武汉康复得生物科技股份有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月8日