介孔分子印迹荧光探针的制备及其检测四环素类抗生素的制作方法
【专利摘要】介孔分子印迹荧光探针的制备及其检测四环素类抗生素，它涉及一种四环素类抗生素残留检测的方法。本发明的目的是要解决现有检测四环素类抗生素残留的方法存在样品预处理过程繁琐，分析时间长且成本高的问题，及现有的分子印迹聚合物?量子点复合材料对目标分子的选择性差、比表面积较小及吸附量低的问题。制备方法：一、分子印迹聚合物的制备；二、Mn掺杂ZnS量子点的制备；三、介孔分子印迹荧光探针的制备。使用方法：将介孔分子印迹荧光探针加入到含有四环素类抗生素的样品溶液中，超声使其分散均匀后进行荧光检测。本发明制备的介孔分子印迹荧光探针选择性好，灵敏度高。
【专利说明】
介孔分子印迹荧光探针的制备及其检测四环素类抗生素
技术领域
[0001] 本发明涉及一种四环素类抗生素残留检测的方法。
【背景技术】
[0002] 四环素类抗生素是最常用的抗生素，除了用于治疗自身疾病，在动物养殖、水产养 殖方面也有广泛应用，然而抗生素的大量滥用已经严重威胁到人们的身体健康。目前我国 常用检测抗生素的方法有液相色谱法或液相色谱与质谱联用法，液相色谱法虽然具有分离 效果好的优点，但用于低浓度加标样品的检测时结果重现性差、分析成本高且分析时间长。 液相色谱与质谱联用法对灵敏度，重现性，选择性的要求非常高，样品预处理过程繁琐，劳 动时间大且分析成本较高。因此，研究一种高效、快捷、低成本的方法用来检测四环素类抗 生素残留对人类健康和生态文明是相当重要的。
[0003] 分子印迹技术是从仿生角度采用人工方法制备对特定分子具有专一性结合作用 聚合物的技术。分子印迹聚合物制备方便，性能稳定。量子点是一种新型半导体荧光材料， 具有荧光量子产率高、斯托克斯位移大的优点。若能将分子印迹聚合物与量子点进行结合， 制备得到的复合材料便可以既具有分子印迹聚合物的高选择性，又可以具有量子点的荧光 特性。Liu等（Liu J X,Chen H,Lin Z,Lin J M.Preparation of Surface Imprinting Polymer Capped Mn-Doped ZnS Quantum Dots and Their Application for Chemiluminescence Detection of 4-Nitrophenol in Tap Water.Anal.Chem.2010,82: 7380-7386)，以及专利CN 104877163 A和CN 103724570 A分别制备得到了基于分子印迹聚 合物-量子点复合材料的荧光探针，并分别应用于选择性分离分析对硝基苯酚、菊酯类农药 和氨基甲酸酯类农药。在这些复合材料中，模板分子与功能单体是通过非共价键结合，得到 的产物对目标分子选择性稍差。此外，这些复合材料比表面积较小，吸附量较低。
[0004] 本发明在合成材料的过程中，功能单体首先通过共价键和模板分子结合，模板分 子被洗脱掉后，印迹孔穴与模板分子再结合时是通过氢键作用。这样既保留了共价键良好 的选择性，也通过氢键作用提高了方向性，有利于模板分子的快速结合和释放。此外，我们 将介孔硅作为印迹基体，不仅能够有效记忆、保留结合位点的识别空穴，而且有序的孔道也 会使模板分子快速进入孔道内部，接近识别位点，超高的比表面积还能够大大增加吸附量。 本发明旨在制备一种介孔分子印迹荧光探针，用于四环素类抗生素残留的检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是要解决现有检测四环素类抗生素残留的方法存在样品预处理过 程繁琐，分析时间长且成本高的问题，及现有的分子印迹聚合物-量子点复合材料对目标分 子的选择性差、比表面积较小及吸附量低的问题。而提供一种利用介孔分子印迹荧光探针 检测四环素类抗生素残留的方法。
[0006] 介孔分子印迹荧光探针的制备方法，具体是按以下步骤完成的：
[0007] -、分子印迹聚合物的制备:将模板分子（四环素类抗生素，包括土霉素、四环素、 金霉素、氯霉素、地美环素、强力霉素、米诺环素或美他环素)与四氢呋喃以及异氰酸丙基三 乙氧基硅烷混合，在80~100°C下搅拌20~24h(氮气保护），搅拌速度为300~380r/min，随 后通过旋转蒸发仪将四氢呋喃去除掉，得到预聚合溶液;再将预聚合溶液、表面活性剂[聚 环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)或十六烷基三甲基溴化铵]、交联 剂正硅酸乙酯、体积分数为50%~60%乙醇水溶液加入到锥形瓶中，最后加入2~4mol/L NaOH溶液，室温下搅拌2~3h后放入高温反应釜中于110~130°C反应40~50h，反应结束后 进行抽滤，得到固体产物，固体产物用蒸馏水离心洗涤3~5次后加入到80~90°C乙醇溶液 中加热回流20~30h(目的是除去表面活性剂），烘干后再将固体产物和体积分数为80%~ 90 %二甲基亚砜水溶液混合，在140~180°C下搅拌8~1 Oh(目的是除去模板分子），反应结 束后将混合液抽滤再用蒸馏水离心洗涤3~5次，得到分子印迹聚合物;步骤一中所述的模 板分子的质量与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的体积比为lg:4~10mL;步骤一中所述的模板分 子的质量与四氢呋喃的体积比为1 g: 20~40mL;步骤一中所述的预聚合溶液的体积与表面 活性剂的质量比为1 mL: 8~12 g;步骤一中所述的预聚合溶液与交联剂的体积比为1:40~ 50;步骤一中所述的交联剂与体积分数为50%~60%乙醇水溶液的体积比为1:30~40;步 骤一中所述的预聚合溶液与NaOH溶液的体积比为1:15~20;步骤一中所述的固体产物的质 量与体积分数为80 %~90 %二甲基亚砜水溶液的体积比为lg: 20~30mL;
[0008] 二、Mn掺杂ZnS量子点的制备:首先将硫酸锌、氯化锰和蒸馏水加入到锥形瓶中，在 氮气气氛及搅拌速度为300~380r/min的条件下反应10~30min，然后以20~40滴/min的滴 速将物质的量浓度为2~3mmol/mL的硫化钠水溶液滴加到锥形瓶中，持续通入氮气并在相 同的搅拌速度下继续反应25~35min，反应结束后用蒸馏水离心洗涤3~5次，烘干得到Mn掺 杂ZnS量子点；步骤二中所述的氯化锰和硫酸锌的物质的量之比为1:12~13;步骤二中所述 的氯化猛的物质的量和蒸馏水的体积比为lmmo 1:70~90mL;步骤二中所述的硫酸锌和硫化 钠的物质的量之比为1:0.9~1.1;
[0009] 三、介孔分子印迹荧光探针的制备:将步骤一中制得的分子印迹聚合物、步骤二中 制得的Mn惨杂ZnS量子点、硅烷偶联剂(疏丙基二甲氧基硅烷或疏丙基二乙氧基硅烷）、体积 分数为85 %~95 %乙醇水溶液加入到锥形瓶中，室温下搅拌20~30h，反应结束所得固体产 品用蒸馏水离心洗涤3~5次，烘干得到介孔分子印迹荧光探针;步骤三中所述的分子印迹 聚合物与Mn掺杂ZnS量子点的质量比为1:0.5~1;步骤三中所述的分子印迹聚合物的质量 与硅烷偶联剂的体积比为lg:l~2mL;步骤三中所述的分子印迹聚合物的质量与体积分数 为85%~95%乙醇水溶液的体积比为lg:30~40mL。
[0010] 上述介孔分子印迹荧光探针在检测四环素类抗生素残留中的应用，具体是按以下 步骤完成的:首先将介孔分子印迹荧光探针与一定浓度的四环素类抗生素样品溶液混合并 将混合液pH调节至7~8,超声1~2min使其均勾分散，室温下静置10~15min后使用焚光分 光光度计进行荧光分析，即完成介孔分子印迹荧光探针检测四环素类抗生素残留；所述的 介孔分子印迹荧光探针的质量与四环素类抗生素样品溶液的体积比为lmg:l~5mL。
[0011] 本发明优点：1、本发明提供的介孔分子印迹荧光探针的制备方法操作简单，适用 性广;2、分子印迹聚合物聚合时，模板分子与功能单体首先通过共价键结合，模板分子被洗 脱掉之后，特定的结合位点与模板分子通过氢键作用再聚合，兼具共价键和非共价键结合 的优点，如选择性强，方向性高;3、介孔硅作为分子印迹基体，使结合位点位于介孔骨架上， 则不仅能够有效记忆、保留结合位点的识别空穴，而且有序的孔道也会使模板分子快速进 入孔道内部，接近识别位点，比表面积高达400~500m2/g，大大增加了吸附量;4、本发明具 有分子印迹技术及量子点的优点，例如选择性好，当其应用于复杂样品前处理时，可以很好 的清除基体干扰且步骤简单，测定的加标回收率可达90%~100%，此外基于量子点的荧光 检测大大降低了分析时间，整个分析时间在20min之内即可完成;5、基于介孔分子印迹荧光 探针的建立，提供了检测四环素类抗生素残留的新方法，降低了分析成本50%~70%，简化 分析步骤，提高了分析效率，在复杂样品前处理中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0012] 图1是实施例1制备的介孔分子印迹荧光探针的透射电子显微镜照片;从图中可以 看出明显的介孔结构；
[0013] 图2是实施例1制备的介孔分子印迹焚光探针他吸附等温线及孔径大小分布；由图 可知，BET表面积为482.15m2/g;孔径体积为0.51cm 3/g;运用BJH孔径分布函数计算得到该介 孔孔径的平均直径为4.4nm;此外还可以看出，在相对压力由0.4上升到0.6时，吸附量不断 增加，说明在该荧光探针表面存在相当数量的分布均匀的介孔结构;这种结构会降低传质 阻力，改善位点结合性及材料的形貌使其更易识别模板分子，从而提高其选择性和结合能 力；
[0014]图3是实施例1制备的介孔分子印迹荧光探针荧光猝灭机理图；如图a中所示，荧光 猝灭可归因于Mn掺杂ZnS量子点表面的氨基和金霉素模板分子表面的羟基之间的电子转 移，这种电子转移会使得量子点表面的氨基基团和金霉素模板分子之间形成一种复合物， 量子点的能量转移到复合物上，使其荧光猝灭;此外，如b图所示，也可用分子轨道理论解释 荧光猝灭机理;Mn掺杂ZnS量子点的电子吸收紫外光后从基态价电子带激发到导带，随后， 激发态电子返回到基态;在返回过程中，量子点可以发出荧光;此外，当存在金霉素模板分 子时，金霉素和量子点表面的氨基基团之间会形成氢键，这种强的相互作用力会导致量子 点和金霉素之间发生电子转移，激发态的电子可以直接跃迀到复合物的分子最低空余轨 道，复合物的能级高于量子点，所以量子点的激发态电子可在不发光的情况下回到基态，导 致量子点荧光猝灭，从而达到检测金霉素的目的；
[0015] 图4是不同浓度的模板分子对实施例1制备的介孔分子印迹荧光探针的荧光强度 的St ern-Vo lmer方程拟合图；考察的模板分子浓度为50~1000ng/mL，米用Stern-Vo lmer方 程对其进行分析;在Fo/F = KSVCq+l式中，Fo表示没有加入猝灭剂模板分子时的荧光强度，F 表示加入猝灭剂模板分子时的焚光强度，Ksv为Stern-Volmer猝灭常数，Cq为样品中加的猝 灭剂模板分子的浓度;通过实验得到Fo/F = 0.0013Cq+0.9906，在50~1000ng/mL的线性范 围内，相关系数R2为〇. 9995;
[0016] 图5是不同浓度模板分子对实施例1制备的介孔分子印迹荧光探针的荧光猝灭光 谱图；在加入金霉素模板分子之前，由于Mn2+从4T 1跃迀到6A1使得从介孔分子印迹荧光探针 在595nm左右有一个强的吸收峰，随着模板分子浓度的增大，荧光猝灭逐渐加强;这是由于 这种介孔分子印迹荧光探针的印迹空腔与模板分子之间有特定的相互作用，使其对模板分 子具有特异选择性。
【具体实施方式】 [0017] 实施例1:
[0018] 本实施方式是介孔分子印迹荧光探针的制备，具体是按以下步骤完成的：
[0019] 一、分子印迹聚合物的制备:将1.5g金霉素固体与30mL四氢呋喃及6mL异氰酸丙基 三乙氧基硅烷混合，在100°C下搅拌反应24h(氮气保护），搅拌速度为350r/min，随后通过旋 转蒸发仪将四氢呋喃去除掉，得到预聚合溶液;再将〇. 〇5mL预聚合溶液、0.45g十六烷基三 甲基溴化铵、2.25mL正硅酸乙酯、67.5mL体积分数为56%乙醇水溶液加入到锥形瓶中，最后 加入0.875mL 2mol/L NaOH溶液，室温下搅拌2h后放入高温反应釜中于120°C反应48h，反应 结束后进行抽滤，得到固体产物，固体产物用蒸馏水离心洗涤3~5次后加入到85°C乙醇溶 液中加热回流24h(目的是除去十六烷基三甲基溴化铵），烘干后再将lg固体产物和30mL体 积分数为85%二甲基亚砜水溶液混合，在160°C下搅拌8h(目的是除去模板分子），反应结束 后将混合液抽滤再用蒸馏水离心洗涤3次，得到分子印迹聚合物；
[0020] 二、Mn掺杂ZnS量子点的制备:首先将25mmol硫酸锌、2mmol氯化锰和80mL蒸馏水加 入到锥形瓶中，在氮气气氛及搅拌速度为350r/min的条件下反应20min，然后以30滴/min的 滴速将物质的量浓度为2.5mmol/mL的硫化钠水溶液滴加到锥形瓶中，持续通入氮气并在相 同的搅拌速度下继续反应30min，反应结束后用蒸馏水离心洗涤3次，烘干得到Mn掺杂ZnS量 子点；
[0021] 三、介孔分子印迹荧光探针的制备：将〇.25g步骤一中制得的分子印迹聚合物、 0.12 5g步骤二中制得的Mn掺杂ZnS量子点、0.4mL巯丙基三甲氧基硅烷、8mL体积分数为 87.5%乙醇水溶液加入到锥形瓶中，室温下搅拌24h，反应结束所得固体产品用蒸馏水离心 洗涤3次，烘干得到介孔分子印迹荧光探针。
[0022] 实施例2:
[0023] 本实施方式是一种介孔分子印迹荧光探针在检测金霉素中的应用，具体是按以下 步骤完成的：分别将〇.2g介孔分子印迹荧光探针与浓度为50~1000ng/mL的金霉素样品溶 液混合并将混合液pH调节至8,超声2min使其均匀分散，室温下静置lOmin后依次使用荧光 分光光度计进行荧光分析，即完成介孔分子印迹荧光探针检测金霉素中的应用；其荧光检 测条件设置如下： 工作模式：发射扫描； 激发波段：紫外可见； 起始波长：500nm;: 终止波长：700nm;
[0024] 扫描间隔：lnm; 负高压：550V; 激发狭缝：l〇nm:; 发射狭缝：H)nm; ?I I描M度：240rmi/min 激发波 1C': 300nm
[0025]结果表明，由本发明建立的方法得到的金霉素的加标回收率为92.1 %~97.5%， 相对标准偏差(1?0)为2.5%~4.9%，被分析的金霉素的检出限为1〇1^/111匕
【主权项】
1. 介孔分子印迹荧光探针的制备方法，具体是按以下步骤完成的： 一、 分子印迹聚合物的制备：将模板分子与四氢呋喃以及异氰酸丙基三乙氧基硅烷混 合，在80~100°C下搅拌20~24h(氮气保护），搅拌速度为300~380r/min，随后通过旋转蒸 发仪将四氢呋喃去除掉，得到预聚合溶液;再将预聚合溶液、表面活性剂、交联剂正硅酸乙 酯、体积分数为50%~60%乙醇水溶液加入到锥形瓶中，最后加入2~4mol/L NaOH溶液，室 温下搅拌2~3h后放入高温反应釜中于110~130°C反应40~50h，反应结束后进行抽滤，得 到固体产物，固体产物用蒸馏水离心洗涤3~5次后加入到80~90°C乙醇溶液中加热回流20 ~30h(目的是除去表面活性剂），烘干后再将固体产物和体积分数为80%~90%二甲基亚 砜水溶液混合，在140~180°C下搅拌8~10h(目的是除去模板分子），反应结束后将混合液 抽滤再用蒸馏水离心洗涤3~5次，得到分子印迹聚合物;步骤一中所述的模板分子的质量 与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的体积比为lg:4~10mL;步骤一中所述的模板分子的质量与四 氢呋喃的体积比为lg: 20~40mL;步骤一中所述的预聚合溶液的体积与表面活性剂的质量 比为1 m L: 8~12 g;步骤一中所述的预聚合溶液与交联剂的体积比为1:4 0~5 0;步骤一中所 述的交联剂与体积分数为50 %~60 %乙醇水溶液的体积比为1:30~40;步骤一中所述的预 聚合溶液与NaOH溶液的体积比为1:15~20;步骤一中所述的固体产物的质量与体积分数为 80%~90%二甲基亚砜水溶液的体积比为1 g: 20~30mL; 二、 Μη掺杂ZnS量子点的制备:首先将硫酸锌、氯化锰和蒸馏水加入到锥形瓶中，在氮气 气氛及搅拌速度为300~380r/min的条件下反应10~30min，然后以20~40滴/min的滴速将 物质的量浓度为2~3mmol/mL的硫化钠水溶液滴加到锥形瓶中，持续通入氮气并在相同的 搅拌速度下继续反应25~35min，反应结束后用蒸馏水离心洗涤3~5次，烘干得到Μη掺杂 ZnS量子点；步骤二中所述的氯化锰和硫酸锌的物质的量之比为1:12~13;步骤二中所述的 氯化猛的物质的量和蒸馏水的体积比为lmmo 1:70~90mL;步骤二中所述的硫酸锌和硫化钠 的物质的量之比为1:0.9~1.1; 三、 介孔分子印迹荧光探针的制备:将步骤一中制得的分子印迹聚合物、步骤二中制得 的Μη掺杂ZnS量子点、硅烷偶联剂、体积分数为85 %~95%乙醇水溶液加入到锥形瓶中，室 温下搅拌20~30h，反应结束所得固体产品用蒸馏水离心洗涤3~5次，烘干得到介孔分子印 迹荧光探针;步骤三中所述的分子印迹聚合物与Μη掺杂ZnS量子点的质量比为1:0.5~1;步 骤三中所述的分子印迹聚合物的质量与硅烷偶联剂的体积比为lg:l~2mL;步骤三中所述 的分子印迹聚合物的质量与体积分数为85%~95%乙醇水溶液的体积比为lg:30~40mL。2. 根据权利要求1所述的介孔分子印迹荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中所 述的模板分子为四环素类抗生素，包括土霉素、四环素、金霉素、地美环素、强力霉素、米诺 环素或美她环素。3. 根据权利要求1所述的介孔分子印迹荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中所 述的表面活性剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)或十六烷基 三甲基溴化铵。4. 根据权利要求1所述的介孔分子印迹荧光探针的制备方法，其特征在于步骤三中所 述的硅烷偶联剂为疏丙基二甲氧基硅烷或疏丙基二乙氧基硅烷。5. 权利要求1~4任何一项所述方法制备介孔分子印迹荧光探针在检测四环素类抗生 素残留中的应用。6.如权利要求5所述的介孔分子印迹荧光探针在检测四环素类抗生素残留中的应用， 具体是按以下步骤完成的:首先将介孔分子印迹荧光探针与一定浓度的四环素类抗生素样 品溶液混合并将混合液pH调节至7~8,超声1~2min使其均勾分散，室温下静置10~15min 后使用荧光分光光度计进行荧光分析，即完成介孔分子印迹荧光探针检测四环素类抗生素 残留；所述的介孔分子印迹荧光探针的质量与四环素类抗生素样品溶液的体积比为lmg:l ~5mL〇
【文档编号】G01N21/64GK105820585SQ201610214652
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】陈立钢, 张靓, 贾丽娜
【申请人】东北林业大学