专利名称：：一种四环素分子印迹整体柱的制备方法一种四环素M印迹smi的制备方法S^领域l本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及肝印迹^4的制备，具体的说，是涉及四环素^[4素具有特异性识另啲肝印迹^ffi的制备。
背景技术：
：四环素^t生素(tetracyclines,TCs)是由,菌产生的一,谱抗生素，作为饲丰顿加剂，在畜牧#^直中用来预防、控制和治疗水产动、植物的病虫害等疾病，逸就很容易导致动物源性食品的药物残留，舰人类鶴构成了潜在的危害。许多国就TCs残留鄉例行监控，我国规定动物源性食品中四环素^C^素的最大残留限量为0.1mg/kg。目前农产品中四环素^fe素残留检测方法主^W:①微生物法检测的特异'(4M、灵,低、检出限高(>3mg/tg)，目前自很少；②,免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA):是目前进行'腿筛±要、{顿,泛的方法，灵鹏较高(0.1—1ng/L),但检测试剂主要^t口，棘高，可适舒一些易处理的样品(尿样、血液等)的现场、'腿检测，但当样品中含有与抗生素结构相类似的其它化合物时，可能出现假阳性结果，严响结果判定。③色谱法其中高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)和气相色谱街GasChromatogmphy，GC)，是国际上公认的四环素^fe素残留定量检测的方法。但是这数法雜样品前处Sil程錢、价格昂贵、分^3IM曼等缺点，不适針现场、'腿检观扮析。由于农产品中基质成分复杂，大多数常规检测方法往往无法从这些复杂样品中准确检测到痕量赃素残留，直接导致ELISA等快速检测方法出现假阳性高等问题、HPLC和GC等色谱法出鹏时长(3天以上)。因此，如何从錢样品中检测出四环素残留已经成为食品安全检测工作中重要的研究课题，其中样品的前处理是食品中抗生素残留检测中的关键步骤。有固相萃取(solid-phaseextraction,SPE)^^Mai^^的专门用于样品纯化和，的一项技术，是在许多领鹏行样品预处理的标准模式，也是目前赃素残留检观仲样品前处理中的主流技术。SPE的核心是i辩斗，目前可鹏于SPE的填料种姓魏活性碳、^K^酸、镁氧化铝等。这對专统填料中的吸附剂与固相萃取中的目标物质之间的作用力是非特异性的，因此限制了固相萃取技术的进一步紙肝印迹技术是一种高选择性的仿生识别方法，以其操作简单、聚合物的选择断、性能稳定、价,宜靴点，用于固相靴、色谱柱±真料中。之前也有将其用于固相靴四环素離生素的鹏。如Caro,E.等以本体聚合法制备了土霉素(OTC)好印迹聚激并将其作为固相萃取材料成功萃取了动物组织的四环素l^fc^素(Caro，E.;Marc6，R.M.;CormacKP.AG;Sherrington^D.C.;Borrull,F.Synthesisandapplicationofanoxytetracyclineimprintedpolymerforthesolid-phaseextractionoftetracyclineantibiotics.Anal.Chim.Acta2005,552，81-86)。Mffli(monolithiccolumn)是吸取了无孔i辩斗和膜的'^I分离能力及HPLC多孔i真料的高容量，又没有增加柱阻力这几方面的优点而^^来的一种新型高效液相色谱填料，而分子印迹，柱(MolecularImprintingMonolithicColumn)兼具分子印迹与，柱的优点，具有高效、'决速、专一的特点，IB可以满足复杂样品前处理的要求。目前，还没有以四环素離生素为微肝制^T印迹Mtt的相^t。
发明内容1本发明的目的，决大多数四环素，生素残留的常规检测方法往往无法从复杂样品中准确樹则到;(i4抗生素残留，直親致ELISA等鹏检测方法出现假阳性高、而HPLC和GC等色谱法出J赚时长(3天以上)的问题，麟一种四环素肝印迹聚溯^4的制备方法，该法步骤简单，可得到避免繁琐研磨过程、針识别性能好的印迹聚激，直接作为新型液相色谱iftf斗可用于离线^线固相,前处理，从而达到去除复杂样品中的杂质、选择性富集痕量四环素皿生素残留的目的。本发明提供的四环素分子印迹，柱的制备方法，包括以下歩骤第一、将四环素超声溶解于极性溶剂中，然后加入功能单体、致L剂混合、超声，静置作用4-6小时形成复她第二、向上步形成的复合物中加入交联剂、引发剂，超声脱气，时间为5-10min;通氮气,，时间为20min;将混合液S!A不Wltt^f后热引发聚合反应；第三、将上步合成的好印迹鄉柱接到高压输顿上，清洗除去致L剂和模板舒，得到四环素M印^^ffi;其中，第一步所述的极性貌!J为甲醇；功能单体为甲基丙烯酸；致孔剂为环己醇和十二醇混合液；第二歩m的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；所述的热引发^f牛为6CTC7K浴中反应12小时。戶腿的f嫩肝、功能单体、交联剂的物质的质量比为1:8:35、1:8:40、1:8:45、1:8:50、或1:8:60;环己醇和十二醇的质量比分别为11:0、7:4、6:5、5:6、4:7、2:9、或O:ll。甲醇用量为可溶解皿^T的最小用量，致L剂总用量为功能单体、交联剂总体积的2倍，引发剂用量为、混合液总质量的1%第二歩中所逸的不自柱，柱长为10cm。第三步臓的清洗液为甲醇、或術只比为94:6的乙腈/乙酸溶液。本发明的储和积极舰本发明制备的四环素針印Mffi与传统本條合得到的聚^tf相比，具有如下的优点-1、制备过程简单易行，不,柱中合g需研磨即可作为色谱固定相；2、得到的,固定相有大孔结构可以保证快的传质速W1较低的背压；3、肝鄉胜能好。/A^ffl价值考虑，本发明所,的四环素^印迹整^i作为一种液相色谱壤抖，可实SM四环素生素的分离、富集和纯化，克服目前M色谱检测方J^质干,重的缺点。1图1-5为不同交联剂用量的M印迹^MiSEM图。具体实船式实例1.首先将微肝四环素TCO.lmmol超声溶縱20mmo1甲醇中，力口M孔剂(环己醇UOg)功能单体MAA0.8mmo1，使之相互作用6h以形成复合物，再加入交联剂EDMA4mmo1(TC:MAA:EDMA=1:8:40)、弓l发剂AIBN20mg，溶液^il^声脱气5-10min，通氮气,20min^然后将此混合液a!A到10cm不糊柱中，热引发60'C水浴反应12h。将制得的針印迹Slttm到高压输^h分别用甲醇、乙腈/乙酸(94:6，v/v)溶液清洗除去致孔剂和丰嫩針得到聚合物1(證l)。实例2.加A^孔剂(十二醇1.10g)，其他同实例l实例3.加Ag[孔剂(环己醇(X20g和十二醇0.90g)实例4.力口AE孔剂(环己醇0.40g和十二醇0.70g)实例5.加Ag[L剂(环己醇0.50§和十二醇0.60§)实例6.加Ag[孔剂(环己醇0.608和十二醇0.5(^)实例7，可得MIP20，其他同实例l，可得MP3。，其他同实例l，可得MIP4。，其他同实例l，可得MIP5(图2)。，其他同实例l，可得MIP6。加Ag[孔剂(环己醇0.70g和十二醇0.40g),其他同实例l，可得MP7。实例8加入交联剂EDMA3.5mmol(TC:MAA:EDMA-l:8:35)，其他同实例5，可得MIP8(图l)。实例9加入交联剂EDMA4.5mmol(TC:MAA:EDMA4:8:45)，其他同实例5，可得MIP9(图3)。实例10加入交联剂EDMA5.0mmol(TC:MAA:EDMA4:8:50)，其他同实例5，可得MIPIO(图4)。实例ll加入交联剂EDMA6.0mmol(TC:MAA:EDMA^:8:60)，其他同实例5，可得MIPll(图5)。Mii不同交联剂用量得到的肝印迹^4SEM图可以看出，随着交鹏的增加，帝勝的整#^孔，小，同Wttffi也越高。为了^ffi^比合^^l的选择性能，做了如下实验实验12.用0.5mL/min乙腈/乙酸(98:2,v/v)溶液作为流动相测试MtPl-MIP9对磺胺甲恶嘴SMO)和四环素(TC)的分离效果；用0.3mL/min乙腈/乙酸(96:4，Wv)溶液作为流动相测试MP10对磺胺甲恶喷SMO)和四环素(TC)的分离效果；用O.lmUmin乙膨乙酸(90:10,v/v)溶液作为流动相测试M1P11对^K甲恶唑(SMO)和四环素(TC)的分离媒。表l聚合鹏中各物鹏觀不同交職的印迹聚^tKt磺應甲恶喚SMO)与四环素(TC)的分离5姊<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>容量因子(r)由公式r-(/^y&计算，其中&和rfl分别f^四环素(tc)的保留时间及体系的死时间；分离因子(a)由公式a=A:'7c/A:'m)计鼠其中A'tc和分别是四环素(TC)和磺胺甲恶嘴SMO)的容量因子。权利要求1.四环素分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一、将四环素超声溶解于极性溶剂中，然后加入功能单体、致孔剂混合、超声，静置作用4-6小时形成复合物；第二、向上步形成的复合物中加入交联剂、引发剂，超声脱气，时间为5-10min；通氮气除氧，时间为20min；将混合液注入不锈钢柱封好后热引发聚合反应；第三、将上步合成的分子印迹整体柱接到高压输液泵上，清洗除去致孔剂和模板分子，得到四环素分子印迹整体柱；其中，第一步所述的极性溶剂为甲醇；功能单体为甲基丙烯酸；致孔剂为环己醇和十二醇混合液；第二步所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；所述的热引发条件为60℃水浴中反应12小时。2、根据权利要求l戶腿的方法，，征在于丰鎌^、功能单体、交联剂的物质的质量比为1:8:35、1:8:40、1:8:45、1:8:50、或1:8:60;环己醇和十二醇的质量比分别为11:0、7:4、6:5、5:6、4:7、2:9、或O:ll。3、根据权利要求1或2戶脱的方法，其特征在于甲醇用量为溶解鎌肝的最小用量，致孔剂总用量为功能单体、交联剂总術只的2倍，引发剂用量为混合液总质量的1%。4、根据权利要求1或2戶腿的方法，赚征在于第三步臓的清洗液为甲醇、或#^、比为94:6的乙腈/乙酸溶液。5、根据权利要求1或2臓的方法，辦征在于第二歩中臓的不糊柱，柱长为10cm。全文摘要四环素分子印迹整体柱的制备方法。其步骤如下将模板分子四环素(TC)超声溶解在甲醇中，加入功能单体、致孔剂(环己醇和十二醇)振荡作用6小时后，加入交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯)、引发剂(偶氮二异丁腈)，超声脱气后通氮气20min除氧，将此溶液注入已封住下端的10cm不锈钢柱，封住上端后将其放入60℃水浴中反应12小时热引发反应得到分子印迹整体柱。将柱子接到高压输液泵上清洗除去致孔剂和模板分子，最后可得到具有良好分离效果的分子印迹整体柱。本方法与传统本体聚合方法相比，具有制备简单、避免繁琐的研磨过程、分子识别性能好等特点。本发明所提供的分子印迹整体柱作为一种液相色谱填料，可实现对四环素类抗生素的分离、富集和纯化。文档编号G01N30/00GK101246150SQ20081005254公开日2008年8月20日申请日期2008年3月28日优先权日2008年3月28日发明者何锡文,孙祥丽,张玉奎,李文友,陈朗星申请人:南开大学