禽流感病毒核酸通用快速检测方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，它确立了禽流感病毒核酸通用快速检测方法，含有三个技术要点：确立了核酸检测所需要的引物序列；确立了检测反应种类；确立了检测反应体系和反应条件。该核酸检测方法可以用于各亚型禽流感病毒的科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。
【专利说明】
禽流感病毒核酸通用快速检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域;具体说来，本发明确立了禽流感病毒通用快速检测方 法，用于各亚型禽流感病毒的快速检测，在体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域有较 大的使用价值。
[0002]
【背景技术】
[0003] 禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病 性禽流感。其中，高致病性禽流感是由H5和H7亚型的某些毒株引起的疾病。
[0004] 病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对禽流感病毒通用的各种 核酸检测方法，包括农业行业标准或国家标准，耗费时间都比较长，如农业行业标准(禽流 感病毒RT-PCR检测方法，NY/T 772-2013)至少需要2 h，国家标准(禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法，GB/T 19438.1-2004)至少需要1.2 h，目前没有比这些方法效率更高的检测 方法。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明针对上述现有禽流感病毒通用检测技术的不足，开展了深入研究和测试， 建立了基于重组酶聚合酶扩增技术的禽流感病毒核酸通用快速检测方法，仅需20 min即可 完成检测。该方法包括以下三个方面内容： (一) 确立了核酸检测所需要的引物序列，针对各亚型禽流感病毒HA基因中保守区域， 设计引物序列，其中上游引物序列含有3 0个碱基，序列为 ggtagatgttgaaagatgagtcttctaacc(即序列表中SEQ ID NO. 1)，下游上游引物序列含有30 个喊基，序列为gaatacaaatcccaagatccctttagtcag(即序列表中SEQ ID N0.2); (二) 确立了基于重组酶聚合酶扩增技术的快速检测方法； (三) 确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μL、 反应缓冲液29.5 μL(含有(^了？、(《^\(1111\(10^等四种核苷酸）、第一步所合成的上游引物 2.4 μL(浓度为10 μ mol/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μL(浓度为10 μ mol/L)、酶混合 物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB)和链置换 DNA聚合酶]1.0 yl、RNA酶抑制剂1.0 μL、需要检测的流感病毒核酸2.0 μ1(从临床样品或 其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）、醋酸镁(280 mmol/L)2.5 μL;然后将反应体系密 闭，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40°C 20 min;反应结束后，在反应产物 中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为207 bp 的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0007]
【具体实施方式】
[0008] 下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施 例。
[0009] 本实施例用重组酶聚合酶扩增技术，对多亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包 括如下步骤： 第一步（合成引物）：按照本发明指定的核酸序列（即序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2)，人工合成重组酶聚合酶扩增反应所需要的上游引物和下游引物； 第二步（配置反应体系）：在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μL、反应缓冲液 29.5 μL(含有(^了？、(16了？、(11'了？、(1013等四种核苷酸）、第一步所合成的上游引物2.4以1(浓 度为10 μ mol/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ1(浓度为10 μ mol/L)、酶混合物[逆转录 酶、能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB)和链置换DNA聚合 酶]1.0 yl、RNA酶抑制剂1.0 μL、需要检测的流感病毒核酸2.0 μL(从临床样品或其他样品 中用核酸提取试剂盒提取的）、醋酸镁(280 mmol/L)2.5 μL; 第三步（反应）：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反 应，反应条件为40°C 20 min; 第四步(结果检测）：在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼 脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为207 bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为 阴性。
[0010] 实际应用结果:对480份!15、册、!17、!19、!110亚型禽流感病毒标准阳性临床样品进行 检测，以及300份标准阴性样品，用上述禽流感病毒快速核酸通用检测技术进行检测，结果 显示该技术的灵敏度为100 .〇%，特异性为100.0%。
【主权项】
1. 禽流感病毒核酸通用快速检测方法，采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征是可以检 出所有亚型禽流感病毒。2. 禽流感病毒核酸通用快速检测方法，其特征有两个:一是可以检出所有亚型禽流感 病毒;二是采用重组酶聚合酶扩增反应。3. 禽流感病毒核酸通用快速检测方法，其特征有三个:一是可以检出所有亚型禽流感 病毒;二是采用针对各亚型禽流感病毒Μ基因保守的区域而设计的一对引物;三是采用重组 酶聚合酶扩增反应。4. 禽流感病毒核酸通用快速检测方法，可采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征有两个： 一是可以检出所有亚型禽流感病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为 ggtagatgttgaaagatgagtcttctaacc，或与 gaatacaaatcccaagatccctttagtcag 序列有 10 个或 10个以上的碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示 相应的喊基）。5. 禽流感病毒核酸通用快速检测方法，其特征有两个:一是采用重组酶聚合酶扩增反 应；二是检测反应采用的两条引物，其序列分别为ggtagatgttgaaagatgagtcttctaacc^PI gaatacaaatcccaagatccctttagtcag，或与这两个序列有10个或10个以上的碱基序列相同的 序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基）。
【文档编号】C12R1/93GK105986044SQ201610066605
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年1月29日
【发明人】蒋文明, 陈继明
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心