一种新的羊毛甾烷型三萜烯类化合物及其制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种新的羊毛甾烷型三萜烯类化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的羊毛甾烷型三萜烯类化合物，可以从干燥满山红中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对前列腺癌细胞株PC3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有浓度——时间依赖性关系。化合物（Ⅰ）可能成为晚期前列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择，可以用来开发成治疗前列腺癌的药物。
【专利说明】
一种新的羊毛甾烷型三萜烯类化合物及其制备方法和医药 用途
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥满山红中分离得到的一种具有治疗前 列腺癌作用的羊毛留烷型三萜烯类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 满山红为杜鹃花科杜鹃花属植物兴安杜鹃的干燥叶，俗称映山红、达子香等。秋、 冬采，晒干，分布于黑龙江、吉林、内蒙古等地，生于山脊、山坡及林下酸性土壤上。始载于 《东北常用中草药手册》，其味辛、苦、性寒，具有止咳、祛痰的功效，主要用于治疗急(慢)性 支气管炎和哮喘，且镇咳、祛痰效果较好。以满山红为原料制成的制剂主要有:消咳喘、映山 红片、复方满山红糖浆、止咳喘冲剂、复方满山红胶囊、复方满山红片等。
[0003] 近些年，相关学者对满山红所含化学成分进行了大量的研究，从中分离鉴定了数 十种化合物。其中主要类型有黄酮类、挥发油类、香豆素类、酚酸类、三萜类等。
[0004] 现代药理研究表明满山红具有镇咳、平喘祛痰作用，降压、利尿作用，镇痛作用，对 中枢抑制作用等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从干燥满山红中分离得到的一种具有治疗前列腺癌作 用的羊毛留烷型三萜烯类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将干燥满山红粉碎，用75~ 85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁 醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯 萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集 75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅 胶分离，依次用体积比为85:1、45 :1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组 分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩 得到纯的化合物(I)。
[0008] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0009] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0010]药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0011] 所述的化合物(I)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0012] 所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0013] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0014] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0015] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0016] 图1为化合物(I)结构式； 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较； 图3为不同浓度化合物（I)作用72h后PC3和DU145存活率； 图4为10.0 mg/L化合物（I)作用不同时间后PC3和DU 145存活率。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0018] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试 剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0019] 制备方法：（a)干燥满山红（10kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(25L X 3次），合并提 取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L X 3次）、乙酸乙酯(3L X 3次)和水饱和的正丁醇 (3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a )中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇 洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（163g);(c)步骤(b) 中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积）、45:1(8 个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体 积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱 得至1」3个组分；（e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18分离，用 体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得 到纯的化合物（I) (143mg )。
[0020] 结构确证:黄色油状物;册43頂3显示[1+似]+为111/2 507.3108，结合核磁特征可 得分子式为C3QH44〇5，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δ Η(ΡΡπι，DMSO-?，500MHz ) : H-1 (1 · 67， m)，H-l(1.86，m)，H-2(2.31，m)，H-2(2.49，m)，H-5(2.17，ddJ=2.3，15.1)，H-6(2.28，m)，H-6(2.45,m),H-12(2.58,d,/=16.9),H-12(2.66,d,/=16.9),H-15(1.73,m),H-15(2.06,m), H-16(1.32，m)，H-16(1.67，s)，H-17(2.15，m)，H-18(0.81，s)，H-19(1.21，s)，H-20(1.35， m)，H-21(0.89，dJ=6.4)，H-22(l ·77，πι)，Η-23(1·58，πι)，Η-24(2·37，(1，/=10·3)，Η-26 (3.39,d,/=11.2),H-26(3.74,d,/=11.2),H-27(1.01,s),H-28(1.07,s),H-29(l.ll,s),H-30( 1.17, s);核磁共振碳谱数据Sc(ppm，DMS〇-^，125MHz) :35.1(CH2，1-C)，34.0(CH2,2-C)， 215.8(C，3-C)，49.7(C，4-C)，49.2(CH，5-C)，36.9(CH2,6-C)，201.3(C，7-C)，151.6(C，8-C)，149.7(C，9-C)，38.6(C，10-C)，202.1(C，n-C)，51.2(CH2，12-C)，46.7(C，13-C)，46.8 (C，14-C)，31.9(CH2，15-C)，27.3(CH2，16-C)，48.6(CH，17-C)，17.1(CH 3，18-C)，18.2(CH3， 19-C)，36.4(CH，20-C)，18.7(CH 3,21-C)，33.3(CH2,22-C)，28.6(CH2,23-C)，63.1(CH，24-C)，64.8(C，25-C)，67.5(CH2,26-C)，20.3(CH 3,27-C)，27.4(CH3,28-C)，21.1(CH3,29-C)， 26.1((^ 3,30-〇;碳原子标记参见图1。11?谱表明该化合物含有羟基（3435(3111_1)，羰基 (1732(^ 1)和双键（1646(^1)基团。13C NMR谱显示出30个共振碳信号，包括七个甲基，九个 亚甲基(一个含氧亚甲基），四个次甲基(一个含氧次甲基），以及十个季碳(两个烯烃季碳， 三个羰基，一个含氧季碳），表明这是一个三萜骨架。HMBC谱中Η 2-2(δΗ2.31，m; 2.49，m)，H-5 (3!12.17，(1(1，/=2.3，15.1抱），]^-28(3!11.07,8)和]^-29(3!11.11，8)与(：-3(3〇215.8)的交叉 峰表明C-3为酮羰基。两个烯属碳信号[SC151.6(C-8)，149.7(C-9)]，以及红外双键吸收带 表明08和09之间为双键。!1]\?(：谱中!1-12[ 5!12.58(1!1，(1，/=16.9泡），2.66(1!1，(1，/= 16.9他）]与(：-11(6〇202.1)的相关性表明(：-11也为羰基碳。两个含氧碳信号[6063.1((：-24)，64.8(C-25)]以及氢质子信号（δΗ2.37，d，J=10.3)表明该化合物含有一个24，25-环氧 基团。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该 化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0021] 实施例2:化合物(I)药理作用试验 一、材料和仪器 前列腺癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98%，用二甲基亚矾(DMS0)配制成浓度为1.Og/L的储存液备 用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清 (FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰蛋白酶购自华美生物工程公 司。二甲基亚砜(DMS0)购自上海华舜生物工程公司。琼脂(Agarose)、二硫苏糖醇(DTT)、苯 甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。十二烷基磺酸钠(SDs)、三氯 甲基烷基甲烧(Tris) Tris-Hcl、Tritonx-100为Promega公司产品。丙稀酞胺、过硫酸钱 (AP)购于苏州化学试剂厂产品。
[0022] C02细胞培养箱(ShellLab)，倒置相差显微镜(Nikon)，超净工作台（苏州净化设备 厂），流式细胞仪（BD)，F039300A型酶标仪（Sunrise)，高压蒸汽灭菌器（Hirayama HA-300MD)，低温超速离心机(Kubota 3740)，万向摇床(江苏麒麟医用仪器厂TS-92)，电泳仪 (Gibco公司），LXJ-n型离心机(上海医用分析仪器厂），DK600型电热恒温水浴箱(上海精密 试验设备公司），电子天平(METTLER TOLEDO)，台式干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）， 紫外分光光度仪(Beckman)。
[0023]二、试验方法 1、细胞培养与养护 1.1细胞培养 细胞株培养于肿瘤医院中心实验室。培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，另 添加谷氨酞胺(2mmol/L)和抗生素（100U/青霉素和100mg/L链霉素），置37°C、饱和湿度、含 5%C0 2气体的培养箱中培养。
[0024] 1.2细胞传代 ①于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁，即可传代。传代前用75%酒精擦拭经过紫外 线照射的超净工作台和双手。②用吸管吸去培养瓶中的旧培养液，用PBS清洗3次。③加入 0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶液2mL进行消化，静置约5分钟，并不时在倒置相差显微镜下观 察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片时，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰蛋白酶的 作用。④用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液，吸入10mL离心管中平衡离心（1000转/ 分)5分钟。⑤弃去上清液，加入2mL培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，1: 2~3分装 入新培养瓶，添加培养液适量于孵箱中继续培养。
[0025] 2、细胞形态学观察 倒置显微镜观察：将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿，培养24h后加入 10.0 mg X Γ1，化合物（I)处理24，48，72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变并记 录。
[0026] 3、细胞毒试验(CCK-8法） ①培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后按照3X104个细胞/孔接种于96孔 板，每孔加0. lmL培养基，常规培养于37°C、含5%C02气体的培养箱中。②试验分组:设阴性对 照组（有细胞但不加药，0.1%DMS0)，空白对照组（无细胞仅有培养液），化合物（I)分别 2 · 5mg/L，5 · 0mg/L，10 · 0 mg/L和20 · 0 mg/L共6组。③24小时后观察细胞贴壁生长良好，分别 按上述试验分组向96孔板内加药，每组设6-8个重复孔。④加药后将96孔板移入37°C、含5% C02气体的培养箱中继续分别培养24、48和72小时。⑤每组试验结束时每孔加入CCK-8 10μ L，37°C培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔的吸光度(0D)值，测定波长为450nm， 参考波长为600nm。⑥按照以下公式计算出细胞存活率（cell viability)，然后绘制成图 表，存活率为50%时的值即为IC5Q。细胞存活率(％)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]X100%。其中As为试 验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔。
[0027] 4、集落形成试验 ①取对数生长期细胞，计数后以3 X 102个接种于6孔板，每孔加2mL培养基，常规培养于 37°C、含5%￡02气体的培养箱中。②24h后观察细胞贴壁生长良好，分别加入不同浓度（0， 2.5,5.0,10.0,20.0mg/L)化合物（I)处理，每组设3个重复孔。③加药后将6孔板移入37°C、 含5%C〇2气体的培养箱中继续14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色，计算每孔集落数（多50个 细胞的计为一个集落）。⑤计算集落形成率:集落总数/接种细胞数X 100%。
[0028]三、结果及结论 1、化合物（I)气对PC3和DU145细胞形态的影响 镜下见对照组细胞贴壁生长，相邻细胞融合成片，细胞呈类圆形或梭形，体积较大，排 列紧密，边缘光滑，胞质饱满，核膜、核仁等结构轮廓明显，细胞生长迅速;经10. 〇mg/L化合 物（I)处理后，细胞密度逐渐降低，生长速度明显减慢至几乎停滞，细胞逐渐脱落并漂浮于 培养液中。细胞体积缩小，胞膜皱缩，成小圆形或不规则形态，胞内多见小颗粒状物质。药物 作用时间越长，细胞形态学改变越明显。
[0029] 2、细胞毒试验 不同浓度化合物（I)对前列腺癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。2.5，5.0， 10.0,20.011^/1化合物（1)作用两种细胞24,48和7211后的存活率如下表所示(表1及表2)。其 中，10.011^/1化合物（1)作用于？03和01]145细胞24,45,7211后的细胞存活率分别为56.2%， 42 · 5%，24 · 3%和50 · 8%，32 · 6%，20 · 7%; 2 · 5，5 · 0，10 ·0，20 ·Omg/L，化合物（I)作用两种细胞 72h后的存活率分别为54 · 3%，37 · 7%，24 · 3%，13 · 2%和52 · 4%，32 · 8%，20 · 7%，11 · 2%(见图 3及图 4)。两因素方差分析示不同浓度与不同时间处理组之间差别具有统计学意义(P〈0.05)，提 示化合物（I)对PC3和DU145的生长抑制作用呈时间浓度依赖。
[0030] 3、集落形成试验 试验显示，对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67.7和64%，而2.5，5.0，10.0， 20 ·Omg/L化合物（I)处理组分别为60 · 7%，51 · 3，39 · 3%，27 · 0%和49 · 7%，34·0%，27 · 7%，15 · 7% (见表3)。这进一步证实了化合物（I)对PC3和DU145细胞具有增殖抑制作用。
[0031] 结论，本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证化合物（I)对前列腺癌细胞株 PC3和DU145的作用，且抑制作用具有浓度一一时间依赖性关系。化合物（I)可能成为晚期前 列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择。
[0032]表1不同浓度化合物（I)作用于PC3后的细胞存活率
表2不同浓度化合物（I)作用于DU145后的细胞存活率_
表3不同浓度化合物（I)作用下PC3和DU145的集落形成率
实施例3 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或 甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例 加入赋形剂，制粒压片。
[0033] 实施例4 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸 或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
[0034] 实施例5 胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比 为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0035] 实施例6 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸 或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封 灭菌制成注射液。
[0036] 实施例7 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅 拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉 针剂。
[0037] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将干燥 满山红粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗 脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中75%乙 醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烧-甲 醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20: 1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用80%乙醇热 回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/58GK106083974SQ201610385341
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月3日 公开号201610385341.4, CN 106083974 A, CN 106083974A, CN 201610385341, CN-A-106083974, CN106083974 A, CN106083974A, CN201610385341, CN201610385341.4
【发明人】郑巧丹
【申请人】郑巧丹