Nadph依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶及其制备方法
【专利摘要】NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶及其制备方法，涉及一种同时含黄素腺嘌呤二核苷酸和[2Fe?2S]铁硫簇的还原酶，其在苯酚降解系统中负责从还原型辅酶Ⅱ(NADPH)获得电子并传递给苯酚羟化酶，是重要的电子传递蛋白；还可以作为氧化还原酶直接催化NADPH和某些电子受体，作为生化反应的催化剂。通过克隆基因重组表达，纯化后的重组MhpP蛋白纯度高，辅基装配完好，具有催化NADPH和电子受体细胞色素C、铁氰化钾、氯化硝基四氮唑蓝的能力。MhpP新颖的序列特点和特异的NADPH依赖性表明其是一种新的还原酶。CCTCC No：M 201020320100816
【专利说明】
NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶及其制备方法
技术领域
[00011本发明涉及来源于嗜酸硫化芽孢杆菌TPY的一种NADPH依赖型双辅基氧化还原酶 即苯酚羟化酶还原酶及其制备，以及其作为电子传递蛋白在依赖NADPH为电子供体的电子 传递反应中的应用。
【背景技术】
[0002] 细菌多组分单加氧酶是一类可利用分子氧羟化有机物底物的多组件酶系统，在有 机物的生物降解方面有重要的意义。可溶性甲烷单加氧酶、苯酚单加氧酶、甲苯单加氧酶等 多组分单加氧酶系统都属于这一家族。细菌多组分单加氧酶家族的酶通常由多个组件酶共 同完成催化有机物的功能。该家族的所有酶一般都含有三个保守组件:具有氧化有机物底 物活性的羟化酶组件，具有电子传递功能的还原酶组件，调控和偶联电子传递与催化反应 的调节酶组件。其中，还原酶作为电子传递链中最关键的蛋白，通常为羟化反应的第一步 酶，为整个羟化反应提供还原力，影响着整个羟化反应的反应速率。
[0003] 多组分单加氧酶的还原酶组分通常是一个38~45kDa的含有黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)和[2Fe-2S]铁硫簇为辅基的铁硫黄素蛋白，通过辅基将电子从还原型辅酶I/IKNAD (P)H)传递给末端羟化酶。这些还原酶在氨基酸序列上都是具有铁氧还蛋白（Ferredoxin) 结构域和铁氧还蛋白还原酶(FNR，Ferredoxin_NAD(P) +reductase)结构域的铁硫黄素蛋 白。其中Ferredoxin保守结构域为结合[2Fe-2S]铁硫簇的四个半胱氨酸，FNR结构域为结合 FAD和结合NAD(P)H的几个保守基序。
[0004] 还原酶组分通过结合和氧化NAD(P)H获得电子，在体内把电子通过自身携带的辅 基传递给末端氧化酶活性中心，为有机物的生物降解提供还原力。比如可溶性甲烷单加氧 酶的还原酶是甲烷单加氧酶系统不可缺少的组件在甲烷代谢中起重要作用，针对可溶性甲 烷单加氧酶的还原酶已有一系列深入的研究。在体外这种可以氧化NAD(P)H为NAD(P)+的还 原酶还可以作为一种生物催化剂，应用于酶法氧化还原反应或者直接催化外源电子电子受 体，完成电子传递过程。
[0005] 在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY中，苯酚羟化酶由mhpLMNOP五个基因编码组成的多组分 酶，其中mhpP编码了苯酚羟化酶的的还原酶组件。
[0006] 本
【申请人】在中国专利CN20 1 1 10026855 . 8中提供了嗜酸硫化芽孢杆菌 (Sulfobacillus acidophilus)TPY，该菌是从太平洋深海热液口（12.2'29''N，104·2'01'' W，水深3083米)分离到，已于2010年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC Νο:Μ 2010203。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一目的是提供一种来源于嗜酸硫化芽孢杆菌（S u 1 f 〇 b a c i 11 u s acidophilus)TPY的NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP。
[0008] 本发明的第二目的是提供一种来源于嗜酸硫化芽孢杆菌（S u 1 f 〇 b a c i 11 u s acidophi lus) TPY的NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP的制备方法。
[0009]所述嗜酸硫化芽抱杆菌(5111:1^(^&(3；[11118&(^(10口11；[1118)1?￥已于2010年8月16日保 藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC No: Μ 2010203(见本
【申请人】的中国专利CN201110026855.8)。
[0010] 所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP的分子类型为蛋白质，序列长度为350个氨基酸残基，序 列如下所示： 1 MAYRIRIEPL GREISAPQST liILD|\CL?)G IWLPHACTHG T€G：TCKAQ?L EGEIDYGDAS 61 SFALMDFBRE DGYALLCQAK PLSDWWAE VDVEEGVBFP ：L￥EDYRAMW HVDPVSPLVR 121 RVTLELDKDT VLLPGQYKQW E￥PGHQ￥KRA YSMQ1TGRK LHFHIKYSPQ GVASBW￥FNS
[0011] 181 LRFGDQYALS GPYGRFFLRP PDGSPAVPLA GGTGLAPIM MimLYLQRP DYPATLIFGA 241 RTMELYDDK YFRALSTAHP TFRYLMVSD ETPPDNSHW SGRVDEVIAF? TFERLQGHKA 302 YVAePSPH?D ACVAALYQKR LMKDiYRlil) FiiTQEKIIG^T IKSPLSia^Ro
[0012] 所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophi lus) TPY的NADPH依 赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP，由mhpP基因编码，该基因在其全基因组(GenBank登录 号:CP002901)中的标签为tpy_0634，基因 mhpP的分子类型为双链DNA，长度为1053bp，拓扑 结构为线性，核苷酸序列如下： 1 ATGGCATATC GCATTCGCA丁丁GMCCGTTG GGACGGGAGA TTTCCGCCCC GCAAGGTACC 6:1 AACATTCTCf； ATGCCTGCCT TCGTCAAGGA ATTTGGTTGC CTCAC(；CGTG CACCCAT(；GT
[0013] 121 ACCTGCGGCA CCTGTAAAGC CCAGGTGTTG GAAGGGGAGA TCGATTACGG CGATGCTTCC 181 AGTTTCGCGC TGATGGATTT TGAGCGCGAA GACGGGTATG CGCTGTTATG TCAAGCCAAA 241 CCGTTAAGCG ACGTGGTCGT CGAGGCGGAG GTGGACGTCG AGGAAGGGGT AGAATTCCCG 301 CTAGTGGAAG ATTACCGGGC TATGGTGGTC CATGTCGACC CGGTTTCGCC CTTGGTCCGC 361 CGCGITACCC TGGAATTGGA TCGCGAiACC GTCTl^ACJGC CCGGGCAATA TTTTCAGl'GG 4：21 GAGGTTCCTG GGCACCAGGT CAAACGCGCC TACTCGGCGG CGCAAATAAC CGGGCGCCGA 481 CTGGAGTTCC ACATCMATA TTCGCCGCAA GGGGTGGCCT CCGAATGGCT GTTTMCTCA 541 TTACGCCCCG GCGATCAGGT GGCATTGTCG GGACCCTACG GACGGTJTTJ' TCTGCGGCCT Θ01 CCGGACGGGT CTCCGGCGGT ATTTCTGGCA GGAGGAACGG GATTGGCGCC GATCAAGGCG
[0014] 661 ATCATTACCG CCCTTTACCT CCAACCGCCG GATTACCCGG CGACCTTGAT CTTTGGGGCC 721 CGMCGGTGG ATGAGCTCTA TGACGACAAG TATTTTCGGG CATTGAGTAC GGCACATCCC 7B1 ACCTTTCGTT ACCTGCCCGC CGTATCCGAC GAGACGCCCC CGGACAACAG CCATGTAGTG 841 AGCGGGCGCG TGGATGAGGT CATCGCGCGG ACGTTCGAGC GTTTGCAAGG GCATAAAGCC 901 TACGTCGCGG GACCGTCGCC AATGGTAGAC GCGTGTGTCG CGGCGTTGTA TCAAAAACGT 961 TTGTTTGCCC GCGATATTTA TCGCGAAGAC TTTTTTACCC AGGMGAGCA TGGTCMACC 1022 ΑΤΤα?ΑΓτΤΓ rGTTAAGCCG GCfiGGrACCT TAA。
[0015] 所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP的氨基酸残基序列具有氮末端类似于铁氧还蛋白 (Ferredoxin)的结构域和中部及碳末端类似于铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NAD(P) + reductase，FNR)的结构域，其中属于氮末端类似于铁氧还蛋白结构域的与结合[2Fe_2S]铁 硫簇有关的四个半胱氨酸残基保守位点为Cys37-X4-Cys42-X2-Cys45-X3i_Cys77,属于中部及 碳末端类似于铁氧还蛋白还原酶的结构域，包括结合黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的保守基 序心49乂￥1513 152和GmXXS173以及结合还原型辅酶I/n(NAD(P)H)的保守基序G212XG2 14XXP2n和 Y301XA3Q3G3Q4P3Q5等。在保守结构基序Y3QlXA3Q3G3()4P3()中第303位为丙氨酸残基(A3Q3)，不同于其 他铁氧还蛋白还原酶及铁氧还蛋白还原酶类似蛋白中在该位置的高保守半胱氨酸残基。
[0016] 本发明所述一种来源于嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的 NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP，其蛋白的氨基酸序列在亲缘关系上亲近于假 单胞菌的苯酚羟化酶还原酶，但氨基酸序列相似度不高(低于40% )。
[0017] 本发明所述一种来源于嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的 NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP，以黄素腺嘌呤二核苷酸FAD和[2Fe-2S]铁硫簇 为辅基。在还原型辅酶I(NADH)和还原型辅酶Π (NADPH)之间偏好于以还原型辅酶Π (NADPH)为电子供体。
[0018] 所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 1)以嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的基因组DNA为模版， 进行mhpP的PCR扩增；
[0020] 在步骤1)中，所述mhpP的PCR扩增的引物序列如下：
[0021] F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC，
[0022] R:5 '-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC，
[0023] 划线部分GGATCC代表限制性内切酶BamH頂每切位点，GCTAGC代表限制性内切酶 Nhe頂每切位点；
[0024]所述PCR扩增是在25yL的反应体系中进行，含0.5yL模板，lyL引物F，lyL引物R，2yL 10XdNTP，2.5yL 10XPCR Buffer，0.5yL Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用H2O将总 体积补至25yL，PCR反应条件为：94°C 5min，30个循环（94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin)，72 °C延伸 10min，4°C pause。
[0025] 2)以pET-His为载体，构建原核表达重组质粒pET-His-mhpP;
[0026] 3)以重组质粒pET-His-mhpP转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达与纯化蛋白；
[0027] 在步骤3)中，所述重组质粒pET-Hi s-mhpP转化大肠杆菌BL21 (DE3)后，可将阳性克 隆菌按照1:100的比例转接于含氨苄青霉素的100mL LB液体培养基中，37°C培养至0D6Q()nm= 0.5~0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)使其终浓度为0.2mM，转移至28°C培 养6~7h;诱导后蛋白大量表达在上清，将上清用结合缓冲液结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲 液，500mM氯化钠，pH=7.4)混匀后，与平衡后的镍介质室温结合过夜。用含咪唑的洗脱缓冲 液(20mM磷酸钠缓冲液，500mM氯化钠，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱蛋白。
[0028] 4)通过光谱扫描、薄层层析、电子顺磁共振鉴定蛋白的两个辅基；
[0029]在步骤4)中，所述光谱扫描鉴定辅基和催化实验时，扫描波长为190~800nm，使用 仪器为岛津UV-1800分光光度计;所述薄层层析时，所用的延展剂为正丁醇/乙酸/水（10:3: 5)，标准品黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)配制摩尔浓度为50μΜ;所述电 子顺磁共振鉴定蛋白所用仪器为Bruker ΕΜΧ-10/12波谱测定仪，测定条件参数如下：调制 频率为100kHz;微波功率为7mW;调制振幅为5G;时间常量为20ms;温度为90K。
[0030] 5)以NAD(P)H为电子供体，添加人工电子受体，建立催化电子传递反应体系，检测 蛋白的电子传递生化活性。
[0031] 所述催化电子传递反应体系包括50mM的磷酸盐缓冲液，pH 7.4;0.1mM NADPH或 NADH; 5yg MhpP;电子受体(0.1 mM细胞色素 c或0.25mM铁氰化钾或0.25mM氯化硝基四氮唑蓝 (NBT))，反应体系总体积为200yL，温度条件为25°C。
[0032]两方面的测定，对NADPH的氧化以及对电子受体细胞色素 c、铁氰化钾、氯化硝基四 氮唑蓝(NBT)的催化还原。
[0033] 本发明通过构建重组原核表达载体，在大肠杆菌中进行重组蛋白表达，获得了辅 基装配完好、纯度高且有活性的NADPH依赖型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP，克服了从嗜酸 硫化芽孢杆菌TPY分离纯化MhpP过程产量低、辅基损失等不足，为进一步研究嗜酸硫化芽孢 杆菌TPY的苯酚降解系统奠定基础。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于提供一种新的还原酶，其具有新颖的氨基酸 残基序列和较高的催化电子传递活性。另外，其在电子供体的选择上，具有不同于大多细菌 多组分羟化酶还原酶组分的NADH依赖性，而具有NADPH依赖性。
【附图说明】
[0035]图1为蛋白MhpP的氣基酸序列比对分析，分为氣末端序列比对即铁氧还蛋白 ferredoxin结构域(A)和中部及碳末端比对即铁氧还蛋白还原酶FNR结构域，FNR结构域包 括结合黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的保守基序(B)和结合NADPH的保守基序(C)。
[0036] 图2为重组MhpP蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。Μ:蛋白Marker; 1:含重组载体pET-Hi s-mhpP的大肠杆菌BL21 (DE3)诱导表达及超声破碎后上清;2:含载体质粒pET-His的大肠杆菌 BL21 (DE3)诱导表达表达及超声破碎后上清;3:镍柱介质纯化所得的目的蛋白即重组MhpP。
[0037] 图3为纯化后的蛋白MhpP-His与其黄素辅基的紫外-可见光谱扫描结果，其中 curve 1为MhpP蛋白紫外-可见光谱扫描结果，curve 2为分离出的含黄素辅基的紫外-可见 光谱扫描结果。
[0038]图4为TLC检测黄素辅基。1 :FAD标准品；2: FMN标准品；3 :MhpP加热煮沸去除变性不 溶物后的黄素上清。
[0039]图5为电子顺磁共振检测[2Fe_2S]铁硫簇辅基，三个特征表面张力g值分别为 2·07、1·93、1·88〇
[0040] 图6为酶对NADPH氧化过程的扫描光谱。ΝΑΗ)Η的特征吸收峰340nm和NADP+特征吸 收峰260nm的吸收值随时间变化。
[0041]图7为酶对催化铁氰化钾电子受体催化过程的扫描光谱。其特征吸收峰420nm的吸 光值随时间减少。
[0042] 图8为酶对催化氯化硝基四氮唑蓝电子受体催化过程的扫描光谱。其还原产物特 征吸收峰550nm的吸光值随时间增加。
[0043] 图9为酶对催化细胞色素 c电子受体催化过程的扫描光谱。还原型细胞色素 c特征 吸收峰550nm的吸光值随时间增加。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔（著），黄培堂(译），《分子克隆实验指南》， 科学出版社，2002年，第三版）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条 件。
[0045] 为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
[0046] 1.一种来源于嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依赖 型双辅基苯酚羟化酶还原酶MhpP与一些蛋白进行序列比对，软件DNAMAN用于序列比对。来 自Acinetobacter sp.ADP1的苯甲酸双加氧酶还原酶BenC，来自Pseudomonas sp·CF600的 苯酸轻化酶还原酶P5,以及植物铁氧蛋白（Ferredoxin)和以及植物和细菌的铁氧还蛋白还 原酶（FNR，Ferredoxin_NAD(P) +reductase )用于序列比对。结果显示MhpP具有N端 Ferredoxin结构域和FNR结构域（图1) JhpP的保守位点包含N端属于Ferredoxin结构域的 四个半胱氨酸保守位点CyS-X4-Cy S-X2-CyS-X29-35-Cy S(图1A)，以及C端属于FNR结构域的结 合FAD的保守基序RXY/FS和GXXS/T(图1B)，以及结合NAD(P)H的保守基序GXGXXP和yXCGp等 (图1C)。其中基序yXCGp中的高保守半胱氨酸残基几乎在所有FNR蛋白和FNR相似蛋白中保 守存在，但是在MhpP中这个半胱氨酸残基被丙氨酸残基替代。
[0047] 2.嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY mhpP基因的PCR扩增
[0048] 以嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY总DNA为模板，用引物F和 R扩增苯酚羟化酶还原酶mhpP基因。
[0049] F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC；
[0050] R:5，-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC；
[0051] 划线部分GGATCC代表BamH頂每切位点，GCTAGC代表Nhe頂每切位点。
[0052] 在25yL的反应体系中含0.5yL模板，lyL引物F(10yM)，lyL引物R(10yM)，2yL 10 X dNTP，2.5yL 10XPCR Buffer，0.5yL Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用H2O将总体积 补至25μΙ^ΡΟ?反应条件为：94°C 5min，30个循环（94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin)，72°C延 伸10min，4°C pauselCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中， 菌落PCR后选取有DNA片段的阳性克隆测序。
[0053] 3.嗜酸硫化芽抱杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY mhpP基因的表达和蛋白 MhpP的纯化
[0054] 将含有mhpP基因的质粒用BamH I和Nhe I酶切，胶回收mhpP基因片段，同时将质粒 pET-His也用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜（12~16h)。连接产物转化到大肠杆菌感 受态细胞DH5a中，提取质粒，测序验证。将测序正确的质粒pET-His-mhpP转化BL21(DE3)，37 °C生长15h后菌落PCR验证质粒转化的正确性。挑选转化正确的菌落，接种到200mL含有100μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C摇培至A 6QQ = 0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)至终浓度0.2mM，28°C诱导5~6h;将菌液收集至200mL的离心管中，6,000转/分钟离 心lOmin沉淀细菌细胞;将细菌细胞重新悬浮在20mL结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，500mM 氯化钠，pH= 7.4)中，超声波处理至菌液成半透明，再11，000转/分钟离心20分钟，弃沉淀； 将上清用结合缓冲液混匀后，与平衡后的镍介质(GE公司）室温结合过夜。使结合液流出，用 结合缓冲液冲洗4-5个柱体积后，用含咪唑的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，500mM氯化 钠，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱蛋白。收集洗脱后的蛋白装入透析袋，透析袋加入含甘油的磷 酸盐缓冲液（NaCl 1.37mM，KCl 2.7mM，Na2HP〇4.12H2〇10mM，KH2P〇4 2mM，5%glycerol，PH 7.4)，4 °C透析24h。透析后的蛋白加入超滤管中，4 °C 3，000转/分钟超滤浓缩，得到的重组蛋 白MhpP-His经12 %的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为45kDa(图2)。
[0055] 4.重组嗜酸硫化芽孢杆菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY NADPH依赖型双辅 基苯酸轻化酶还原酶MhpP的辅基鉴定
[0056] 4.1紫外-可见光光谱扫描法检测蛋白MhpP
[0057]使用岛津UV-1800分光光度计对蛋白进行波长扫描，以磷酸盐缓冲溶液进行基线 校正，设定扫描范围190-800nm，扫描步长lnm。取蛋白（浓度500ι^/πιυ200μL加入比色皿中， 扫描检测。所得光谱如图3 curve 1所示。扫描光谱带有黄素特征吸收峰与铁硫簇特征吸收 峰。
[0058] 4.2蛋白MhpP的黄素辅基鉴定
[0059]将蛋白MhpP置于沸水加热5分钟后，12,000转/分钟离心10min去除变性蛋白沉淀， 得到的黄色上清进行光谱扫描和薄层层析（TLC)。光谱扫描步骤同上，得到的光谱如图 3curve 2所示。TLC实验使用正丁醇/乙酸/水（10:3:5)为展开剂<^40和?1财示准品购于 51区11^-41(11'；[011，标准品配制浓度为5(^1。展开剂配制混勾后倒入层析缸中盖上盖子放置一 段时间，使层析缸中充满展开剂达到饱和。用铅笔在薄层层析硅胶板上做上记号，点样点距 低端约1.5~2cm，每个样点之间的距离约为lcm，前后两个样点距边缘约lcm。待展开剂到达 距硅胶板顶端约lcm时取出硅胶板。硅胶板用吹风机吹干后置于365nm紫外灯下荧光显色。 结果显示该黄素上清是FAD而非FMN，证明蛋白MhpP的黄素辅基为FAD(图4)。
[0060] 4.3蛋白MhpP的铁硫簇辅基鉴定
[0061]蛋白MhpP充分还原后，转移到核磁管中使得加样液面为2cm。含样品的核磁管置于 液氮中冷冻。Bruker EMX-10/12波谱测定仪用于进行电子顺磁共振(EPR)实验，测定条件参 数如下：调制频率，100kHz;微波功率，7mW;调制振幅，5G;时间常量，20ms;温度，90K。EPR波 谱图显示^^?具有几个特征表明张力值(8七6118〇1')，分别为81 = 2.07、82 = 1.93、83 = 1.88 (图5)，与植物铁氧还蛋白的[2Fe-2S]铁硫簇的EPR特征g值一致。
[0062] 5.重组苯酚羟化酶还原酶MhpP的酶活分析
[0063] 25°C条件下，反应体系中加入50mM的磷酸盐缓冲液，pH 7.4;0.1mM NADPH;5yg MhpP;三种电子受体的一种，包括0.1 mM细胞色素 c或0.25mM铁氰化钾或0.25mM氯化硝基四 氮唑蓝(NBT)。使得反应体系总体积为200yL。反应混合物通过岛津UV-1800分光光度计监测 吸收峰的变化。酶对NADPH的氧化呈现出NADPH在340nm特征吸收峰随时间的减少，和氧化态 形式的NADP+在260nm的吸收峰随时间的增加（图6)。酶对几种电子受体的催化中，对铁氰化 钾的催化，造成铁氰化钾在420nm的最大吸收峰随时间减少（图7);对NBT的催化，造成NBT被 还原的产物甲臜物在550nm波长吸收值随时间增加（图8)，并且甲臜颗粒久置后聚集成紫黑 色沉淀。对细胞色素 c的催化造特征成氧化型细胞色素 c在530nm最大吸收峰的吸收值随时 间减少，还原型细胞色素 c在520nm和550nm的最大吸收峰吸收值随时间增加（图9)〇 [0064] 一个单位(U)的酶活定义为每分钟催化Ιμπιο?的电子受体的所需要的酶量。根据电 子受体的特征消光系数，计算酶对细胞色素 C(￡55〇nm= )、铁氰化钾（e42〇nm = 1.02mM-Vm-1)、NBT(e55Qnm= 28mM-Vm-1)的催化活性，实验重复三次取平均值。该酶对三种电 子受体的催化比活力（specific activity)测定结果显示，以细胞色素 c为电子受体酶活为 1.7±0.36U，以铁氰化钾为电子受体时酶活为0.78±0.13U，以氯化硝基四氮唑蓝为电子受 体时酶活为0.16±0.06U。显示酶对几种电子受体具有催化活性，并且偏好于NADPH为电子 供体。
【主权项】
1. 一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌（Sulfobacillus acido地ilus)TPY的NADPH依赖型双 辅基苯酪径化酶还原酶MhpP，其特征在于其分子类型为蛋白质，序列长度为350个氨基酸残 基，序列如下所示：2. 如权利要求1所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP，其特征在于由mhpP基因编码，该基因在其全 基因组中的标签为化y_〇634,基因 mhpP的分子类型为双链DNA，长度为1053bp，拓扑结构为 线性，核巧酸序列如下：3. 如权利要求1所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP，其特征在于氨基酸残基序列具有氮末端类 似于铁氧还蛋白（Ferredoxin)的结构域和中部及碳末端类似于铁氧还蛋白还原酶 (Fe;rredoxin-NAD(P)+reductase，FNR)的结构域，其中属于氮末端类似于铁氧还蛋白结构 域的与结合[2化-2引铁硫簇有关的四个半脫氨酸残基保守位点为切S37-X4-CyS42-拉-切S45- X31-切S77，属于中部及碳末端类似于铁氧还蛋白还原酶的结构域，包括结合黄素腺嚷岭二 核巧酸(FAD)的保守基序Ri49XYi5iSi52和GmXXSmW及结合还原型辅酶I/n(NAD(P)H)的保 守基序G212XG214XXP217和Y3〇iXA3〇3G3(mP3日日;在保守结构基序Y301XA3日沁3日化日中第303位为丙氨酸 残基(A303 )，不同于其他铁氧还蛋白还原酶及铁氧还蛋白还原酶类似蛋白中在该位置的高 保守半脫氨酸残基。4. 如权利要求1所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于包括W下步骤： 1. W嗜酸硫化芽抱杆菌（Sulfobacillus acido地ilus)TPY的基因组DNA为模版，进行 mhpP的PCR扩增； 2. W祀T-His为载体，构建原核表达重组质粒祀T-His-mhpP; 3. W重组质粒祀T-His-mhpP转化大肠杆菌化2UDE3)，表达与纯化蛋白； 4) 通过光谱扫描、薄层层析、电子顺磁共振鉴定蛋白的两个辅基； 5. WNAD(P)H为电子供体，添加人工电子受体，建立催化电子传递反应体系，检测蛋白 的电子传递生化活性。5. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述 mhpP的PCR扩增的引物序列如下： F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC， R:5 '-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC， 划线部分GGATCC代表限制性内切酶BamH I酶切位点，GCTAGC代表限制性内切酶Nhe I 酶切位点。6. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述 PCR扩增是在25化的反应体系中进行，含0.扣L模板，1化引物F，化L引物R，化L10XdNTP，2.5 化 10XPCR Buffer，0.扣L Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用出0将总体积补至25化， PCR 反应条件为：941：5111111，30个循环（941：3〇3,571：3〇3,72°(：1111111)，72°(：延伸1〇111111，41： P过use〇7. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述重 组质粒祀T-Hi s-mhpP转化大肠杆菌化21 (DE3)后，将阳性克隆菌按照1:100的比例转接于含 氨节青霉素的lOOmL LB液体培养基中，37°C培养至OD6〇〇nm=0.5~0.6时，再加入异丙基硫 代-β-D-半乳糖巧（IPTG)使其终浓度为0.2mM，转移至28°C培养6~化;诱导后蛋白大量表达 在上清，将上清用结合缓冲液结合缓冲液(20mM憐酸钢缓冲液，500mM氯化钢，抑=7.4)混匀 后，与平衡后的儀介质室溫结合过夜；用含咪挫的洗脱缓冲液(20mM憐酸钢缓冲液，500mM氯 化钢，500mM咪挫，pH 7.4)洗脱蛋白。8. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述光 谱扫描鉴定辅基和催化实验时，扫描波长为190~8(K)nm，使用仪器为岛津UV-1800分光光度 计;所述薄层层析时，所用的延展剂为正下醇/乙酸/水（10:3:5)，标准品黄素腺嚷岭二核巧 酸(FAD)和黄素单核巧酸(FMN)配制摩尔浓度为50μΜ。9. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述电 子顺磁共振鉴定蛋白所用仪器为化址er EMX-10/12波谱测定仪，测定条件参数如下：调制 频率为100曲Z;微波功率为7mW;调制振幅为5G;时间常量为20ms;溫度为90K。10. 如权利要求4所述一种来源于嗜酸硫化芽抱杆菌（Sulfobacillus acidophilus) ΤΡΥ的NADPH依赖型双辅基苯酪径化酶还原酶MhpP的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所 述催化电子传递反应体系包括50mM的憐酸盐缓冲液，pH 7.4;0.1mM NADPH或NADH;5yg MhpP;电子受体(0.1 mM细胞色素 c或0.25mM铁氯化钟或0.25mM氯化硝基四氮挫蓝(NBT))，反 应体系总体积为20化L，溫度条件为25°C。
【文档编号】C12N9/02GK106085978SQ201610411445
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610411445.8, CN 106085978 A, CN 106085978A, CN 201610411445, CN-A-106085978, CN106085978 A, CN106085978A, CN201610411445, CN201610411445.8
【发明人】陈新华, 李朦, 郭文斌
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所