苯酚羟化酶基因及其用途的制作方法

专利名称：苯酚羟化酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从醋酸钙不动杆菌PHEA-2中克隆的苯酚羟化酶基因，以及该基因在增添或增强受体菌降解苯酚能力方面的用途。
背景技术：
苯酚是我国列为严重污染环境和危害人体健康的优先控制污染物。利用环境生物技术是目前消除环境中这类化合物的主要方法。生物处理的核心是通过微生物的代谢活动将废水中的有机物氧化分解为无机物。处理的效果与处理系统中的微生物群落结构、数量、降解菌的降解能力有很大的关系。但是，现有的处理系统中的微生物群落结构不合理，降解菌的降解能力低、底物范围窄等。例如，已有的研究表明，在废水处理系统中，苯酚浓度达440mg/L以上时，微生物的降解速度很慢。当苯酚浓度过高时，活性污泥产生毒性抑制，导致处理效果不佳(如苯酚浓度为800mg/L，活性污泥解体)。因此，广泛存在于印染、制药、橡胶、石油化工等行业废水的芳香化合物尚没有切实可行的治理方法。
很多微生物都具有代谢苯酚等芳香化合物的能力。细菌对几种不同芳香化合物的主要代谢途径为经酶催化将芳香化合物转化为几种中间代谢产物-双酚类化合物原儿茶酚和儿茶酚(Chaudhry G R，Chakrabarty A M.Biodegradation of halogenated organiccompounds.Microbiol.Rev.1991.5559-79，Gibson，D.T.，and V Subramanian.1984，Microbialdegradation of aromatic hydrocarbons，p.181-252.In D.T.Gibson(ed)，Microbial degradation oforganic compounds.Marcel Dekker，Inc.，New York.)，这些二羟基中间产物通过间位开环或邻位开环，最终进入三羧酸循环而完全降解。
一般情况下，经苯酚羟化酶催化，苯酚降解菌将苯酚转化为毒性较小的邻苯二酚，然后邻位或间位开环，经过一系列生化反应氧化为二氧化碳和水。苯酚羟化酶含量的增加可加快苯酚降解的速度。
通过对芳香化合物的代谢途径微生物生物降解的遗传机制的了解，人们提出了降解广底物范围的工程菌株的模式即利用已有的下游降解基因，导入关键酶的基因使底物生成原儿茶酚或儿茶酚中心中间产物，进行降解。由于降解基因成簇排列，大部分由质粒携带，克隆的基因簇如果能在新寄主细胞中正常或高效表达，就可以构建能利用多种芳香化合物的工程菌株，如将bphABCD转入到氯代苯甲酸、氯代苯和2，4-D降解菌株中，就可能使它们降解一些多氯联苯。降解3-氯苯甲酸的Psudomonas sp.B13和降解甲苯的P.putida F1都不能降解氯苯，但当将B13的降解基因转入到F1时，转化后的菌株具有降解氯苯和1，4-二氯苯的能力(Van Der Meer J.R.，Willem M.De Vos，Harayama S.，andAlexander J.B.Zehnder，1992，Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobioticcompounds.Microbiological Reviews，677-694)。表1-2示A.eutrophus遗传工程菌所获得的降解几种氯代芳香化合物的能力。除了克隆单个的基因和基因簇之外，为了拓展微生物利用底物的范围，还可以将一些降解基因及它们的调控基因构建成易操作的基因单元，以便将它们转入到期望的菌株中用于降解有毒废物。

发明内容
本发明要解决的技术问题如下1、提供可将苯酚转化为邻苯二酚的代谢编码基因；2、构建具有完全苯酚羟化酶基因的高频接合转移质粒；3、获得能够增强对苯酚的降解或扩大底物降解范围的遗传工程菌株。
本发明从自然界中筛选分离到一株具有高效降解苯酚能力的醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2，该菌株能以苯酚作为唯一的碳源生长，有效去除废水的苯酚。本发明构建了该菌株基因文库，克隆了苯酚降解途径的关键酶--苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)基因。
将上述基因转入到原始菌株醋酸钙不动杆菌PHEA-2后，提高了PHEA-2菌株的苯酚降解能力；转入到无降解苯酚的能力的甲苯降解菌(假单胞菌)中，使该菌株获得降解苯酚的能力。
本发明具体是通过如下方式实现的1、PHEA-2菌株的筛选本发明采用富集选择培养技术分离苯酚降解菌株。首先用多种芳香化合物作为碳源从含酚炼油废水中进行初筛，然后将细菌分离物从含苯酚的MS平板或上液体培养基中培养，使其在1d内显著生长。通过对一株苯酚降解能力强的菌株的16S rDNA序列分析和生理生化测定，鉴定为醋酸钙不动杆菌PHEA-2。研究表明该菌株具有氯霉素和氨苄，可在24小时内完全降解3mM苯酚。
2、PHEA-2菌株基因文库的构建提取醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2的总DNA，部分酶切后连接到载体Lambda GEM-11上，转染大肠杆菌细菌，获得PHEA-2菌株基因文库。
3、苯酚羟化酶基因文库的克隆从基因文库中筛选到6株阳性重组噬菌体，对阳性重组噬菌体P21的外源DNA进行了序列分析，表明该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，其多核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，该插入片段含有6个完整的开放阅读框(ORF)，分别命名为ORF2～ORF7，其序列推导氨基酸分别与A.CalcoaceticusNCIB8250苯酚羟化酶的6个亚基MopK、L、M、N、O、P有58.5％、72.4％、80.9％、93.5％、60.8％、84.7％的同源性，表1中ORF2～ORF7被命名为mphK、L、M、N、O、P。
表1苯酚羟化酶基因及其阅读框(ORFs)编码的产物基因大小与菌株NCIB8250氨基酸数目GeneSize(bp)的氨基酸序列同源性No.Of amino acidORF2300 58.5％99ORF3999 72.4％332ORF4267 80.9％88ORF5152793.5％508ORF6363 60.8％120ORF7106284.7％3534、苯酚羟化酶基因高频接合转移质粒的构建将含有A.calcoaceticus PHEA-2的苯酚羟化酶完整基因的重组噬菌体P21DNA，SalI完全酶切后，用T4 DNA连接酶将酶切片段连接到具有广寄主范围的特性的自杀性质粒pSZ21中，构建含Tn5苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851。
5、工程菌株的构建及苯酚羟化酶基因的表达将含Tn5苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851与野生型菌株PHEA-2或甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)进行接合，从限制性平板上选择具有km抗性的接合子，经过数次抗性转接筛选后，选取抗性稳定的具有苯酚羟化酶活性的接合子(PHEA-21及A51)。
具体实施例方式实施例1PHEA-2菌株的筛选用多种芳香化合物作为碳源从含酚炼油废水中进行初筛(具体方法取含酚废水1ml，加灭菌水至10ml，振荡摇匀，将100μl涂布含氯苯、苯酚、甲苯、邻苯二酚各200mg/l的LB平板上)，分别接种于含3mM苯酚的MS平板或上液体培养基中，培养物在30℃培养，挑选1天内显著生长的单菌落。对一株能以苯酚作为唯一碳源良好生长的微生物菌株进行16S rDNA序列分析和生理生化测定，研究表明该菌株具有氯霉素和氨苄抗性，接种于3mM苯酚为唯一碳源的MS培养基中，每隔2-3小时取样测定培养液中的苯酚含量(苯酚的含量测定按国家检测标准方法--4-氨基安替比林法)(国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会，1997，水和废水监测分析方法，北京，中国环境科学出版社)，发现在24小时内苯酚被完全降解。该菌株被鉴定为醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticusPHEA-2。
MS无机培养基的配制如下NaNO3，0.50g，K2HPO4，0.65g，MgSO4，0.10g，KH2PO4，0.17g，H2O，1000mL，pH6.8LB培养基的配制如下NaCl，5.0g，胰蛋白胨，10g，酵母膏，5g，H2O，1000mL，pH6.8实施例2PHEA-2菌株基因文库的构建采用细菌总DNA提取的常规方法(CTAB法，Wilson K.Preparation of genomic DNAfrom bacteria.Preparation of genomic from bacteria.1987.P.2.10-2.12.In F.M.Ausubul，R.Bent，et al.Current protocols in molecular biology.J.Wiley & Sons，New York，N.Y.)，提取醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2的总DNA，用适量的限制性内切酶Sau3A I在37℃、水浴条件下对50～100μg总DNA进行部分酶切，酶切片段于0.4％的琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色后，紫外线下切下含15～23kb片段的琼脂糖胶，放入1.5ml的离心管中，加入3～4倍体积的Binding Buffer，在55～65℃水浴条件下，反应约7min到胶彻底溶解，将DNA/琼脂糖溶解液置于回收柱中，室温离心1min，转速为10,000rpm。再加入用无水乙醇稀释的Wash Buffer 750μl，室温离心1min，转速10,000rpm，再加入30～50μl超纯水到离心柱，室温离心1min，转速10,000rpm，将DNA回收到新的灭菌Eppendorf离心管。将回收的15-23kb酶切片段(0.3-0.9μg)、T4连接酶(3U)、载体Lambda GEM-11(1.0μg)，在室温下连接3h，反应体积为10μl，将连接产物转染大肠杆菌，获得PHEA-2菌株基因文库。
实施例3苯酚羟化酶基因文库的克隆通过比较不同苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因的核苷酸序列，设计出一对该基因的特异性引物Lphl(5′-AGG CAT CAA GAT CAC CGA CTG-3)和Lph2(5′-CGC CAG AAC CATTTA TCG ATC-3′)，得到684bp的PCR产物，以此产物为探针，通过杂交从基因文库中筛选到6株阳性重组噬菌体，对其中的阳性重组噬菌体P21的外源DNA进行了序列分析，该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，该插入片段含有6个完整的开放阅读框(ORF)，分别命名为ORF2～ORF7，其序列推导氨基酸分别与A.CalcoaceticusNCIB8250苯酚羟化酶的6个亚基MopK、L、M、N、O、P有58.5％、72.4％、80.9％、93.5％、60.8％、84.7％的同源性，ORF2～ORF7在表1中称为mphK、L、M、N、O、P。
实施例4构建苯酚羟化酶基因高频接合转移质粒及羟化酶基因转移到受体菌中分析发现重组噬菌体P21的SalI片段含有A.calcoaceticus PHEA-2的苯酚羟化酶完整基因，SalI完全酶切后，通过T4 DNA连接酶连接到具有广寄主范围的特性的自杀性质粒pSZ21的Tn5转座子的SalI位点中，构建含Tn5苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851。通过该质粒将苯酚羟化酶基因转移到醋酸钙不动杆菌、假单胞菌等土壤细菌中，使这些菌株获得了苯酚羟化酶的活性。
实施例5工程菌株的构建及苯酚羟化酶基因的表达将含有Tn5苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851供体菌和受体菌(野生型菌株PHEA-2或甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)分别少量培养在LB培养基中过夜，次日分别转接入5ml的LB培养基中培养2h，分别取出1.5ml菌液离心，去上清，再用生理盐水悬浮并离心，重复一次，将离心的菌体悬浮于100μl的生理盐水中，取出30μl按供体受体为1∶1的比例混合，两两混合和不混合的做对照。然后分别滴在LB平板上，将平板置于一个潮湿的器皿中，30℃培养6～8hr，用牙签将它们分别挑起放入1ml LB液体中，悬浮并摇匀，以10-3～10-5的稀释度稀释后，铺于含有Km的A15平板上，30℃培养过夜后挑取单菌落，PCR检测接合子是否含有目的基因--苯酚羟化酶基因。
通过测试重组菌株对苯酚的降解和耐受能力，从几十株转有Tn5苯酚羟化酶基因的A.calcoaceticus重组接合子中筛选到降解苯酚能力增强的PHEA-21，具体筛选方法及降解特性如下从野生型A.calcoaceticus PHEA-2和重组接合子PHEA-21的平板上，挑取单菌落接种在20ml的LB培养液中，30℃ 200rpm过夜摇培，分别以2％的接种量接种到100ml含2mmol/L和4mmol/L苯酚的MS液体培养基中，同时以不加菌的相同培养基作为对照，30℃ 200rpm摇培，每隔3h取5ml样品测定苯酚的含量。测定结果表明，发现在2mmol/L苯酚的MS培养液中，重组接合子PHEA-21在9h内基本上将苯酚全部降解掉，野生型PHEA-2则需15h才能完全降解溶液中的苯酚；在4mmol/L苯酚的MS培养液中，24h后，重组接合子PHEA-21可以将溶液中的苯酚降解掉，而在接种野生型PHEA-2的培养液中，苯酚的浓度几乎没有下降。
同样，转有Tn5苯酚羟化酶基因的甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)的重组接合子A51，接种到以苯酚或甲苯(2mmol/L)为唯一碳源的MS液体培养基上，显示出良好生长的能力。研究表明重组接合子除具有利用甲苯作为碳源生长的特性外，并获得降解苯酚能力的新性状。
SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院原子能利用研究所<120>苯酚羟化酶基因及其应用<130>02-02<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4668<212>DNA<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)<400>1atggagtaca gcatgacgca acctcaagtc gaagcattaa ccaaatatat tcgggtcact60ggcgacttaa atgcagagtt tatcgaattc gattttgcca ttcacgaccc aagtctattt120gtggaactgg ttttgcctaa acatgcattt aaggattttt gtaagaccaa tcaagtggtt180gaaatgaccc aagaacagca agcttttaat gatgctcagg aagaaaaatg gcgctatggc240actgaagcaa ccttagtcgg cacgcaacgt aatagcaacg atcaagatga tcagatgtaa300aaaatataag gagataaagc catgacttta gaaatcaaaa cgtcaaatgt cgaacctatt360cgccagaact acgcctatat cgaaagacga tttggtagta agccagcaac tcgatatcaa420gaagtaagtt ttgatgtaca ggcagaaact aactttcact atcgtccttt gtggaaacct480gaaaagacct taaatgataa aacccatact gccctgcaaa tgcaagactg gtatgcattt540aaagatccac gtcaattcta ttatggaact tatgttcagc accgtgcgcg tttacaggac600acagccgaaa gtaattttgc tttttttgaa aaacgtcagc ttgcagagca tttgtctaac660gaagtcaaag ccaaggttat tgaatgccta ttgccatttc gccacgttga acaaactgca720aacttacaca tgatgtctgg cagtgcctat ggttatggca ccgtacttac ccaagcttgt780atttatgccg cgatggatca tttaggaatt gcgcagtaca tctcacggat tggcttagct840ttagatggca acagcggcga ctcactacag caggcaaaac aggcttggat gcaacatcct900gcatggcaag gcttacgccg tctgtgtgaa gaaagcctca ccgagcaaga ctacttcaaa960
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权利要求
1.苯酚羟化酶基因，其多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的苯酚羟化酶基因在提高受体菌苯酚降解能力方面的用途，其特征是将所述苯酚羟化酶基因转入到醋酸钙不动杆菌PHEA-2中。
3.权利要求1所述的苯酚羟化酶基因在使受体菌获得降解苯酚的能力方面的用途，其特征是将所述苯酚羟化酶基因转入到甲苯降解菌中。
全文摘要
本发明涉及苯酚羟化酶基因及其用途。本发明提供了可将苯酚转化为邻苯二酚的代谢编码基因；构建具有完全苯酚羟化酶基因的高频接合转移质粒；获得能够增强对苯酚的降解或扩大底物降解范围的遗传工程菌株。将苯酚羟化酶基因转入到醋酸钙不动杆菌PHEA－2后，提高了该菌株的苯酚降解能力，转入到甲苯降解菌中，还使菌株获得降解苯酚的能力，扩大底物降解范围。
文档编号C07H21/00GK1500802SQ0214881
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月18日 优先权日2002年11月18日
发明者徐玉泉, 陈明, 张维, 林敏 申请人:中国农业科学院原子能利用研究所