专利名称：一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法
一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法技术领域
本发明属于果品色素提取技术领域，具体地，本发明涉及采用微生物技术手段提取果品色素的技术领域。
背景技术：
天然色素是食品、保健和化妆品等领域重要的添加剂.与合成色素相比，其最大的优点是安全性较高.而且大多数含较高的营养价值和药理活性。红枣在我国南北各地都有分布.产量大，而且富含天然红色素。以红枣或者加工过程中的大量废弃枣皮提取红色素，既综合利用了红枣资源，也对环境保护大有益处。研究表明红枣红色素对氧化剂、还原剂等均具有良好的稳定作用，是一种理想的食品添加剂与药用原料。
红枣富含多种营养成分，具有较高的营养和保健功效。据报道，红枣含有多种酚类物质，且具有较高的抗氧化活性，尤其是枣皮，但目前关于枣皮红色素的研究较少。而红枣红色素是天然的绿色型色素，其色彩鲜艳，具有特殊香味，可增加食品风味。如将它添加在仿生食品中，可以改善食品色调，又与天然色泽相近，从而促进消费者的食欲且安全性高。红枣红色素用于饮料、糖果、酒品等着色，使其色彩艳丽动人。味道酸甜可口。另外，红枣红色素还具有一定的保健作用，添加到保健品中可有助于人们的健康。
随着人们生活水平的提高，对食品感官质量要求也越来越高，开发色调鲜艳，安全无毒的天然食用色素新产品已成为目前天然产物领域研究热点之一。红枣红色素具有良好的稳定性和药理活性.可满足化妆品、食品、染料、饮料等不同行业的需求，是一种极具开发前景的天然色素。我国红枣资源丰富.但对其的综合开发利用尚少。从红枣中提取红色素大多处于试验研究阶段.实现工业化生产还需大量探索与实践。红枣红色素提取工艺目前的研究热点是优化工艺条件，提高提取率。对高纯度的红枣红色索很精制工艺研究不多，仍需在此方面努力，这也是今后有关红枣红色素研究的发展趋势。同时，作为重要的食品添加齐U，红枣红色素提取过程中的安全性问题与绿色化生产也应引起研究人员的注意。此外，应加大研发力度，以期提高产品质量，大幅度降低生产成本，获得良好的经济效益和社会效.、Mo
植物纤维素作为细胞壁的主要结构成分存在于所有的植物中，它是一种均匀葡聚糖，由(l，4)-a-D-吡喃葡萄糖基单位的直链所组成。果胶物质主要是由(l，4)-a-D-批喃半乳糖醛酸基单位组·成的高聚物，存在于细胞壁的中间层。采用纤维素酶和果胶酶的复合酶可以将植物的细胞壁破碎，从而使得壁内物质充分释放出来，这在果蔬汁饮料加工业中已得到应用。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于丝状真菌，曲霉是公认产纤维素酶最高的菌种之一，其中黑曲霉是重要的发酵工业菌种，不仅可用于生产纤维素酶，还被用于生产果胶酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。
目前，现有技术关于红色素或者红枣色素的提取主要集中报道在传统化学浸提法、生物酶法提取等方法，未见关于微生物发酵法提取红枣色素，更未见关于红枣红色素提取的报道。利用微生物发酵法提取红枣色素具有重要的研究开发价值。发明内容
本发明针对现有技术关于红色素或者红枣色素的提取主要集中报道在传统化学浸提法、生物酶法提取等方法，未见关于微生物发酵法提取红枣色素，更未见关于红枣红色素提取的报道的技术现状，本发明提供一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法，充分利用微生物发酵法提取红枣色素，通过利用黑曲霉液体发酵助提获得红枣色素，具有广泛而适用的价值。
本发明采用的主要技术方案: 本发明利用微生物发酵法，采用黑曲霉为发酵菌种，对以红枣皮中的植物纤维素作为碳源发酵产生复合酶，破碎红枣皮细胞壁，提高红枣色素提取得率的发酵条件进行研究，为红枣的有效开发和合理利用提供理论依据。
本发明具体提供一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法，％按照重量百分比计，具体提取方法如下。
(I)过筛:粉碎的红枣皮过40目筛。
(2)液体发酵:将上述步骤经过粉碎过筛的红枣皮粉为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比按重量比为 5: 1，按照制备的发酵液量为添加标准，红枣皮粉添加量为2%，Tween-80为0.02%，接入的黑曲霉液体菌种添加量为10%，在30°C下发酵5d后于121°C灭菌 15min。
(3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih。
(4)浸提:按照0.8% NaOH溶液为提取剂，浸提温度为80°C，将步骤(3)制备的干燥料与提取剂按照料液比为1:20 (g/ml)，浸提时间为4h，提取级数为3级。
(5)离心:将步骤(4)制备的浸提液在4000r/min转速下离心15min,取上清液。
本发明中，黑曲霉菌种是常见的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道获得，黑曲霉是以菌悬液的形式接入发酵培养基的，菌悬液的制备:采用基础培养基将培养了72h±lh的黑曲霉，培养温度为30°C，离心去上清，用与基础培养基等体积的无菌生理盐水清洗3次，最后得到菌悬液；基础培养基为本领域常见的PDA培养基。
本发明采用常见的提取级数即在其他提取条件不变的情况下，对目标产物进行重复提取的次数，具体的，提取级数，即按所述条件进行第一次提取后，离心，将上清和沉淀分离，上清作为第一级提取液备用，由于红枣皮中还有一部分红色素未被浸提出来，故沉淀按相同条件进行第二次提取，再离心分离上清和沉淀，此时上清作为第二级提取液备用，沉淀按相同条件进行第三次提取，再分离上清和沉淀，得到第三级提取液。此时，大部分红枣红色素已被提取出，虽然不是全部提出，但因考虑到实际成本的因素不作更多级提取。
现有技术熟知，红枣红色素为羟基葸醌类衍生物，难溶于丙酮、乙醚等极性较小的有机溶剂；易溶于水，以及甲醇、乙醇等强极性有机溶剂。红枣色素呈红色在不同浓度梯度的乙醇水溶液中表现出橙黄色颜色由深至浅的变化。红枣红色素在碱性条件下相对稳定.光照、还原剂对红枣红色素的影响不大；红枣红色素热稳定良好，在20 1000°C温度变化对其稳定性几乎无影响；金属离子K+、Ca2+、Na+、M2+、Zn2+对其稳定性影响不明显；苯甲酸钠和蔗糖溶液对红枣红色素的稳定性影响较小。它是一种耐糖性色素，稳定性不受人体所需的微量元素的影响。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果。
本发明以黑曲霉为发酵菌株，进行液体发酵法助提红枣色素发酵条件的研究，确定了黑曲霉液体发酵法助提红枣色素的最优发酵条件，以红枣皮为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比5:1，发酵温度30°C，发酵时间5d;与传统化学浸提方法相比，微生物发酵法助提红枣色素的提取得率为9.74%，比传统浸提法提高了 2.11%，改善了红枣红色素的提取效率，可将产品得率提高2.11%，且两种方法所得红枣色素的抗氧化能力相近，均与浓度呈较显著的量效关系。
图1显示为利用黑曲霉液体发酵提取红枣色素的工艺流程图。
图2显示为传统化学法提取红枣色素的工艺流程图。
图3显示为氮源对红枣色素提取得率的影响图。
图4显示为碳氮比对红枣色素提取得率的影响图。
图5显示为发酵温度对红枣色素提取得率的影响图。
图6显示为发酵时间对红枣色素提取得率的影响图。
图7显示为红枣色素对二苯代苦味肼基自由基的清除能力图。
图8显示为红枣色素对羟基自由基的清除能力图。
图9显示为红枣色素的还原能力图。
图10显示为维生素C对二苯代苦味肼基自由基的清除能力图。
图11显示为维生素C对羟基自由基的清除能力图。
图12显示为维生素C的还原能力图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比。
本发明中设备和材料有: 红枣枣皮，实验室自制；黑曲霉为常见的菌种，本领域技术人员可以通过公众渠道获得；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；氯化铵、氢氧化钠、硝酸钠等均为A.R.级。
WFZ-UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；HH — S2数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海-恒科技有限公司；DSX-280AI型不锈钢手提式灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HWY-2112型摇床，上海智诚分析仪器厂；SIM真空冷冻干燥设备，德国西门子公司。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一:利用黑曲霉液体发酵提取红枣色素 具体参见附图1，％按照重量百分比计，具体利用黑曲霉液体发酵提取红枣色素提取方法如下。
(I)过筛:粉碎的红枣皮过40目筛。
(2)液体发酵:将上述步骤经过粉碎过筛的红枣皮粉为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比按重量比为5: 1，按照制备的发酵液量为添加标准，红枣皮粉添加量为2%，Tween-80为0.02%，接入的黑曲霉液体菌种添加量为10%，在30°C下发酵5d后于121°C灭菌 15 min。
(3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih。
(4)浸提:按照0.8% NaOH溶液为提取剂，浸提温度为80°C，将步骤(3)制备的干燥料与提取剂按照料液比为1:20 (g/ml)，浸提时间为4h，提取级数为3级。
(5)离心:将步骤(4)制备的浸提液在4000r/min转速下离心15min,取上清液。
通过上述提供的利用黑曲霉液体发酵提取红枣色素提取方法，以黑曲霉为发酵菌株，进行液体发酵法助提红枣色素发酵条件的研究，确定了黑曲霉液体发酵法助提红枣色素的最优发酵条件，以红枣皮为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比5:1，发酵温度30°C，发酵时间5d ;红枣色素的提取按提取得率计，是以红枣粉末和红色素得率的重量百分比计，微生物发酵法助提红枣色素的提取得率为9.74%，改善了红枣红色素的提取效率。
实施例二:传统采用的化学法提取红枣色素 具体参见附图2，传统采用的化学法提取红枣色素的技术要点如下: 粉碎的枣皮过目筛，经过浸提、离心，将浸提液在4000r/min转速下离心，取上清液，具体制备工艺参数本领域熟知，可采用与实施例一涉及到相同技术步骤的基础参数。
实施例三:黑曲霉液体发酵法助提红枣色素工艺的优化 1.氮源对红枣色素提取得率的影响: 分别选择尿素、蛋白胨、硝酸钠、酵母浸出物、氯化铵作为氮源，按碳氮比6:1加入液体发酵培养基中，考察不同氮源对红枣色素提取得率的影响，结果参见附图3。
为了消耗红枣皮中的植物纤维素，起到改变细胞壁通透性的效果，直接采用红枣皮作为固定碳源，避免了引入其他物质作为碳源后对红枣色素提取得率的影响。此黑曲霉菌株发酵法助提红枣色素的最佳碳源为硝酸钠。
2.碳氮比对红枣色素提取得率的影响: 以红枣皮为碳源，硝酸钠为氮源，将碳源和氮源按3:1、4:1、5:1、6:1、7:1的比例混合，加入液体发酵培养基中进行发酵，考察不同碳氮比对红枣色素提取得率的影响，结果参见附图4。
碳氮比是影响微生物生长`和酶合成的一个重要因素，微生物的生长和微生物酶的合成都有适宜碳氮比范围，采用适宜的碳氮比有助于黑曲霉更好地消耗红枣皮中的植物纤维素，从而起到助提红枣色素的效果。由附图4可知，随着碳氮比的升高纤维素酶的活性由低到高再降低，碳氮比为5:1时吸光值达到最大，为0.393，之后又有一定幅度的下降。综上可得，采用5: I的碳氮比生产纤维素酶。
3.发酵温度对红枣色素提取得率的影响: 以红枣皮为碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比为5:1，将接种的液体培养基分别在28°C、30°C、32°C、34°C、36°C的环境中进行培养，考察不同发酵温度对红枣色素提取得率的影响，结果参见附图5。
由附图5可知，在30°C时，黑曲霉助提红枣色素的效果最佳，粗体液吸光值达0.373。在34°C 36°C时，助提效果逐渐减小。这可能是由于较高温度下，菌体生长较快，但不利于产酶，较低温度下菌体虽生长较慢，但可延长产酶时间。综上可得，30°C是产纤维素酶的最适温度。
4.发酵时间对红枣色素提取得率的影响: 以红枣皮为碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比为5:1，发酵温度为30°C，发酵ld、2d、3d、4d、5d、6d，考察不同发酵时间对红枣色素提取得率的影响，结果参见附图6。
由附图6可知，第I 2d吸光值变化幅度较小，从第3d开始增幅变大，直至第5d吸光值达到最大，为0.476，之后开始呈现一定幅度的下降，这可能与微生物的生长曲线一致。综上可得，最佳发酵时间为5d。
通过采用单因素及正交优化试验确定了黑曲霉液体发酵法助提红枣色素的最优发酵条件为:以红枣皮为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比为5:1，发酵温度为30°C，发酵时间为5d。与传统化学浸提方法相比，微生物发酵法助提红枣色素可将产品得率提高(浸膏质量/红枣质量)2.11%，且两种方法所得红枣色素的抗氧化能力相近，均与浓度呈较显著的量效关系。
实施例四:影响因子正交优化试验 在单因素试验的基础上，进一步选取发酵温度、发酵时间，碳氮比三因素，进行三因素三水平的正交优化试验。
在单因素试验的基础上，选用L9 (33)正交表进行优化，正交试验结果见表1、2。
表I黑曲霉发酵助提红枣红色素正交试验结果
权利要求
1.一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法，其特征在于，％按照重量百分比计，具体利用黑曲霉液体发酵提取红枣色素提取方法如下: (1)过筛:粉碎的红枣皮过40目筛； (2)液体发酵:将上述步骤经过粉碎过筛的红枣皮粉为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比按重量比为5: I，按照制备的发酵液量为添加标准，红枣皮粉添加量为2%，Tween-80为0.02%，接入的黑曲霉液体菌种添加量为10%，在30 °C下发酵5d后于121°C灭菌15 min ； (3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih ； (4)浸提:按照0.8% NaOH溶液为提取剂，浸提温度为80°C，将步骤(3)制备的干燥料与提取剂按照料液比为1:20 (g/ml)，浸提时间为4h，提取级数为3级； (5)离心:将步骤(4)制 备 的浸提液在4000r/min转速下离心15min,取上清液。
全文摘要
本发明公开一种利用黑曲霉液体发酵助提红枣色素的方法。利用黑曲霉为发酵菌种，红枣皮粉为固定碳源，硝酸钠为氮源，碳氮比为5∶1，红枣皮粉添加量为2%，Tween-80为0.02%，接入的黑曲霉液体菌种添加量为10％，在30℃下发酵5d后于121℃灭菌15min，于80℃烘箱中干燥1h，并按照0.8%NaOH溶液为提取剂，浸提温度为80℃，将干燥料与提取剂按照料液比为120(g/ml)，浸提时间为4h，级数为3级，浸提液在4000r/min转速下离心15min，取上清液。与传统化学浸提方法相比，本申请提供方法产品得率提高2.11%，获得良好的技术效果，具有广泛的实用价值。
文档编号C09B61/00GK103232724SQ201310107810
公开日2013年8月7日 申请日期2013年3月31日 优先权日2013年3月31日
发明者敬思群, 王侠, 房芳 申请人:新疆刀郎枣业有限公司, 新疆大学