一种比率型纳米硅量子点荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米材料学和分子生物学技术领域，具体涉及纳米量子点荧光探针及其制备方法，以及在羟基自由基的高灵敏度高选择性地检测和细胞成像中的应用。

背景技术：

硅量子点具有良好的发光性质，近年来引起了材料科学、化学生物学、生命科学研究者的广泛关注。在过去五年内，很多科研工作者在硅量子点的合成方法方面已经做了大量的研究。硅量子点具有生物相容性好，荧光量子产率高及无光漂白的特点，是生物成像应用中较理想的荧光探针，在生命科学领域具有巨大的应用价值。

活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）物质包括：超氧根离子 (O2⁻),单线态氧(O2¹)，过氧化氢(H2O2),羟基自由基(•OH)，次氯酸根 (ClO⁻)和过氧化亚硝酸根(ONOO⁻)。这一类物质是通过细胞或者机体新陈代谢产生，然而羟基自由基(•OH)又称为极强活性氧自由基（highly Reactive Oxygen Species, hROS）具有极强的氧化性，会破坏细胞膜表面的Ca²⁺通道，造成细胞的损伤，甚至会攻击细胞内的蛋白质、核酸。如果ROS在体内大量累积会造成氧化应激反应，诱发疾病甚至癌症的发生。因此，羟基自由基的检测对疾病的早期诊断有重要的临床意义。

羟基自由基(•OH)具有很短的寿命，在液相中仅为1ns，给直接检测带来了困难。一般都是通过与•OH发生化学或生物反应后的产物的间接方法来检测。目前检测活性氧自由基的方法，主要有电子自旋共振法、紫外-可见吸收的方法、荧光、电化学传感法、荧光光谱法。在众多检测方法中，荧光探针对极强活性氧自由基具有非常灵敏的响应，并且具有高度选择性，同时荧光探针可以在细胞内进行成像，在体内进行追踪检测。因此本发明选择荧光探针来检测羟基自由基(•OH)。

羟基自由基(•OH)会淬灭量子点的荧光，若进行体内的检测并且进行成像时，荧光淬灭会造成成像效果不佳等问题。因此，为了追踪细胞内成像情况，一般采用比率型荧光探针来响应羟基自由基的信号。比率型荧光探针分为两个部分，一部分是结合探针，既是与待测物反应后荧光发生变化；另外一部分是指示探针，是反应前后荧光不会发生变化的探针。荧光探针与反应物结合后，可以使用在两个不同波长测定的荧光强度的比率进行测定，称为比率测量。比率型荧光探针测定物质浓度可以消除光漂白和探针负载和设备因素引起的数据变化。

硅量子点的荧光量子产率很高，又具有良好的生物相容性，在细胞成像领域应用广泛。已有研究者通过微波合成法、“一锅法”还原法等方法合成了高量子产率的荧光硅量子点，并对其进行表面修饰改性，合成的量子点荧光量子产率最高达到79%，最低是21%。而硅量子点用于生物分子的检测方面的研究还比较少，羟基自由基对硅量子点荧光性能的影响还未见文献报道。

我们的研究发现活性氧会高效且选择性地淬灭硅量子点的荧光，为硅量子点用于生物小分子的体外检测方面开拓了一个新的方向。但是，如果把这种探针直接应用于细胞成像，对体内羟基自由基的含量进行检测时，由于羟基自由基具有强氧化性能够淬灭荧光，造成成像效果不佳、背景高等问题。因此，本发明设计了比率型荧光探针来检测羟基自由基的信号，在这个新颖的探针中硅量子点的荧光是响应信号，Ce6的荧光为参比信号。在合成方法上，本发明使用静电吸附法。这一方法主要是基于由于硅量子点表面有大量氨基，带正电荷，而Ce6分子有三个羧基基团，当pH大于5时，羧基会去质子化成羧酸根带负电荷。因此可以通过静电吸附作用，使Ce6吸附在硅量子点表面。此外，Ce6的激发光谱和硅量子点的荧光发射光谱有部分重叠，因此两种物质之间会发生荧光能量共振转移（FRET），FRET增强了Ce6在660nm的荧光强度，构建了FRET增强的比率型荧光探针。在此基础上，本发明选择人宫颈癌细胞（Hela）和人肝癌细胞（HepG-2）作为细胞模型, 对细胞内的活性氧进行了检测，并进行了细胞内成像研究。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提出了一种量子产率高、生物相容性好并具有FRET增强特征的比率型纳米硅量子点荧光探针及其制备方法。

本发明的另一个目的在于提供上述比率型纳米硅量子点荧光探针在生物体内的羟基自由基的高灵敏度高选择性地检测，以及在细胞成像中的应用。

本发明提出的比率型纳米硅量子点荧光探针的制备方法，具体步骤包括：

（1）硅量子点的制备，采用的是“一锅法”，室温下，用抗坏血酸钠还原三氨丙基-三乙氧基硅烷，得到水溶性的硅量子点；

（2）硅量子点- Ce6复合材料的合成，将上述合成好的硅量子点(1~3mL) 和50~100μM Ce6在室温避光条件下混合，静置一段时间（一般为40~60小时），Ce6通过静电作用吸附到硅量子点的表面，得到硅量子点-二氢卟吩e6复合材料，记为Si-ce6。

本发明中，所述制备硅量子点的操作过程为：调节磁力搅拌器的转速，室温下加入0.5~5mL 三氨丙基-三乙氧基硅烷、2~ 16mL水、 0.5~ 8 mL 0.1M 抗坏血酸钠溶液，搅拌3-4.5h，溶液由澄清透明变至粉红色，即生成了硅量子点。

上述得到的硅量子点-二氢卟吩e6复合材料，在410nm的荧光激发下发射出430nm~580nm和640nm~680nm的双波长荧光，并且活性氧自由基能特异性地淬灭硅量子的荧光，而对Ce6的荧光基本无影响。基于这一特征，本发明构建了比率型荧光探针，对体外的活性氧自由基实现了高灵敏度、高选择性的检测，而对其他非活性氧物质、其他金属离子均有较好的选择性。

本发明制备的硅量子点-二氢卟吩e6复合材料，可作为比率型纳米硅量子点荧光探针，用于检测羟基自由基（•OH）的含量，以及用于细胞成像。具体内容包括：

（1）Si-ce6用于检测•OH的含量

体外的•OH由Fenton方程产生: Fe²⁺ + H2O2 = Fe³⁺ + OH^- + •OH。将Si-ce6 20~100μL 和10~50μL 5~20mM H2O2混合，然后再加入不同浓度的二价铁溶液，补加一定体积的水，使得终体积是400μL，混合后在25℃~37℃下静置1小时。用荧光光谱仪检测荧光强度。•OH能够选择性地淬灭硅量子点在490nm处的荧光，而对Ce6的荧光基本没有影响，因此Si-Ce6可以作为检测•OH的比率型荧光探针。•OH浓度从1μM到200μM增加时，490nm处的荧光值降低，660nm处荧光值基本不发生变化。我们以660nm和490nm处的荧光强度比值（记为I660/I490）为响应信号，得到了•OH浓度对荧光比率值的标准工作曲线。该探针对•OH的线性检测范围为1μM到 200μM，当S/N=3时，检出限为0.97μM；

pH 稳定性以及离子干扰测试

通过磷酸缓冲液来调节Si-Ce6溶液的pH值在6.5到8之间。结果表明I660/I490不随着pH的改变发生变化，说明该探针的稳定性很好。含有50~200 μM不同金属离子Fe²⁺、K⁺、Fe³⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺、 Zn²⁺和还原型谷胱甘肽（GSH）分别与Si-Ce6 QDs溶液反应，来判断不同种类离子对体系干扰的影响。I660/I490均低于0.8，所以这些金属离子和GSH对该探针基本没有响应。其他活性氧物质如ONOO^-、ClO^-在浓度为200μM时的I660/I490接近1.0，而•OH的I660/I490为2.0，因此•OH对I660/I490响应最强，生物体内的其他金属离子没有任何干扰，而其他活性氧物质干扰较小；

（2）Si-ce6用于体内细胞成像

收集对数期的人肝癌细胞（HepG-2）和人宫颈癌细胞（Hela），用细胞传代的方式获得贴壁细胞悬浮液，用细胞计数板计数，调整细胞密度，获得10⁵~10⁷个/mL的细胞浓度。将50~200μg/mL 的 Si-ce6与细胞，继续在细胞培养箱里面培养1~3小时。随后，用1X磷酸缓冲溶液清洗细胞，彻底洗去未反应的材料。实验组中，本发明采用5~20μg/mL 脂多糖（LPS）刺激细胞产生•OH ，用0.01% ~1% DMSO来清除细胞内的•OH。从激光共聚焦成像图片可以看出细胞和Si-Ce6共同孵育后依然能保持良好的形态，而且在细胞质和细胞膜表面都有荧光，说明Si-Ce6 QDs已经被吞噬到人肝癌细胞内。随着LPS孵育时间的增加，硅量子点的荧光逐渐变弱，说明•OH 淬灭了Si的荧光。而与DMSO共同孵育后，Si的荧光又增强了，这说明二甲亚砜对细胞内的自由基有清除作用。

与现有报道相比，本发明的比率型纳米硅量子点荧光探针合成方法简便，比率型纳米硅量子点荧光探针用于检测羟基自由基（•OH）的含量，快速高效、特异性高、灵敏度高，用于体内细胞成像，生物相容性好，可视化程度高。

（1）合成方法简便：硅量子点的合成采用“一锅法”，不需要复杂的仪器，不需要高温强酸强碱等苛刻条件，反应条件比较温和，反应产物只需普通的荧光光谱仪就可以进行鉴定；硅量子点与Ce6的复合采用静电吸附方法，无需特殊试剂，且产物在不同pH下信号稳定。

（2）快速高效：比率型硅量子点探针与羟基自由基反应时间只需1小时，就能达到有效的荧光淬灭，即可以用荧光光谱仪进行检测。

（3）特异性高：体系中的其他金属离子和小分子如Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、H2O2、NO2^-、NO3^-、谷胱甘肽（GSH）等对该种比率型荧光探针基本没有干扰。

（4）灵敏度高：体外最低检测浓度是1μM, 检出限0.97μM（以信噪比计算，S/N=3），检测的浓度范围 1～200μM。

（5）生物相容性好：此种纳米硅量子点生物相容性好，细胞毒性实验MTT和活体动物实验表明纳米硅量子点没有生物毒性。

（6）可视化程度高：用激光共聚焦显微镜可直接观察活细胞内羟基自由基的产生和分布情况。

附图说明

图1（A） FRET增强型比率型荧光探针合成示意图，（B）检测•OH的原理示意图。

图2 (A) Si-CE6与不同浓度的羟基自由基的荧光信号响应，其中，荧光信号响应曲线对应的羟基自由基浓度，从上至下依次为：1μM，5μM，10μM，20μM，50μM，80μM，100μM，200μM。(B) FL660nm/490nm比值对不同浓度羟基自由基响应的工作曲线。

图3 （A）Si-Ce6 在Fenton体系中发生羟基自由基以及过氧硝酸根、次氯酸根的可行性，其中•OH、ONOO^-、ClO^-、Fe²⁺、Fe³⁺、NO2^-、NO3^-的浓度是200μM, H2O2的浓度是1mM。（B）在生物体内的物质对Si-Ce6的干扰试验，离子浓度是100μM。

图4 癌细胞在不同浓度的Si-Ce6 QDs下的细胞存活率的MTT图。其中，A为人宫颈癌细胞，B为人肝癌细胞。

图5 Si-Ce6的人宫颈癌细胞的激光共聚焦显微成像图。从上到下依次是：A图实验组空白组未做任何处理，B图 100μM ClO^-，C图 100μM抗坏血酸/次氯酸根实验组。标尺=50μm。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步描述本发明。

实施例1

（1）硅量子点的制备

在制备前，先用王水（浓盐酸：浓硝酸=3:1）浸泡25mL圆底烧瓶，浸泡过夜，洗涤干净，烘干并且冷却至室温。调节磁力搅拌器的转速，室温下加入1mL 三氨丙基-三乙氧基硅烷（APTES）、5mL水、1 mL 0.1M 抗坏血酸钠（NaAA）溶液，搅拌4h，溶液由澄清透明变至粉红色，则生成了硅量子点。

（2）硅量子点-二氢卟吩e6复合材料的合成

将上述合成好的硅量子点(1.9 mL) 和50 μM Ce6(0.1mL)在室温避光条件下混合，静置两天两夜，二氢卟吩e6通过静电作用吸附到硅量子点的表面，得到硅量子点-二氢卟吩e6复合材料，记为Si-ce6。

获得Si-ce6 之后，用3K的超滤离心管，转速是8000rpm，超滤3次除去多余的APTES、NaAA，以及Ce6，避免多余物质对下步实验造成干扰。

（3）Si-ce6用于检测羟基自由基（•OH）的含量

把Si-ce6 50μL 和40μL 10mM H2O2混合，然后再加入不同浓度的二价铁溶液，补加一定体积的水，使得终体积是400μL，混合后37℃下静置1小时。用荧光光谱仪测量溶液的荧光。荧光光谱仪激发波长选择410nm，荧光发射波长范围是430 nm ~ 750 nm。

（4） pH 稳定性以及离子干扰测试

配置pH 在6.5 – 8.0的磷酸缓冲溶液，用磷酸缓冲溶液调节Si-Ce6的pH值，用荧光光谱仪检测荧光值。分别配制含有100 μM不同金属离子Fe²⁺、K⁺、Fe³⁺、 Cu²⁺、 Ni²⁺、 Zn²⁺与Si-Ce6 QDs溶液反应，用荧光光谱仪检测荧光强度，进而判断不同种类离子对体系干扰的影响。

（5）细胞培养和Si-ce6用于体内细胞成像

把人肝癌细胞（HepG-2）在Thermo 培养箱里面培养，培养箱的温度是37℃，5%二氧化碳以及细胞培养湿度在100%。配制的培养液含有高糖DMEM和10% 胎牛血清以及0.5%青霉素-链霉素。细胞培养包括细胞复苏、细胞传代以及细胞冻存。收集对数期的人肝癌细胞（HepG-2），用细胞传代的方式获得贴壁细胞悬浮液，用细胞计数板计数，获得10⁵个/mL的细胞浓度。然后把细胞种在细胞培养皿（玻璃基底的培养皿）内，轻轻摇晃均匀，培养12小时后，每个培养皿内加入100μg/mL 的 Si-ce6，继续在Thermo 细胞培养箱里面（37℃，5% 二氧化碳，100%湿度）培养2小时。随后，吸取纳米材料，用1X磷酸缓冲溶液清洗细胞，彻底洗去未反应的材料。

实施例2

（1）硅量子点的制备

在制备前，先用王水（浓盐酸：浓硝酸=3:1）浸泡25mL圆底烧瓶，浸泡过夜，洗涤干净，烘干并且冷却至室温。调节磁力搅拌器的转速，室温下加入2mL 三氨丙基-三乙氧基硅烷（APTES）、10mL水、2 mL 0.1M 抗坏血酸钠（NaAA）溶液，搅拌4.5h，溶液由澄清透明变至粉红色，则生成了硅量子点。

（2）硅量子点-二氢卟吩e6复合材料的合成

将上述合成好的硅量子点(2.5 mL) 和75μM Ce6(0.1mL)在室温避光条件下混合，静置两天两夜，二氢卟吩e6通过静电作用吸附到硅量子点的表面，得到硅量子点-二氢卟吩e6复合材料，记为Si-ce6。

获得Si-ce6 之后，用3K的超滤离心管，转速是6000rpm，超滤3次除去多余的APTES、NaAA，以及Ce6，避免多余物质对下步实验造成干扰。

（3）Si-ce6用于检测羟基自由基（•OH）的含量

把Si-ce6 75μL 和50μL 10mM H2O2混合，然后再加入不同浓度的二价铁溶液，补加一定体积的水，使得终体积是400μL，混合后37℃下静置1小时。用荧光光谱仪测量溶液的荧光。荧光光谱仪激发波长选择410nm，荧光发射波长范围是430 nm ~ 750 nm。

（4）离子干扰测试

分别配制含有100 μM还原型谷胱甘肽（GSH）、其他活性氧物质如ONOO^-、ClO^-与Si-Ce6 QDs溶液反应，用荧光光谱仪检测荧光强度，进而判断不同种类离子对体系干扰的影响。

（5）细胞培养和Si-ce6用于体内细胞成像

把人宫颈癌细胞（Hela）在Thermo 培养箱里面培养，培养箱的温度是37℃，5%二氧化碳以及细胞培养湿度在100%。配制的培养液含有高糖DMEM和10% 胎牛血清以及0.5%青霉素-链霉素。收集对数期的人宫颈癌细胞（Hela），用细胞传代的方式获得贴壁细胞悬浮液，用细胞计数板计数，获得10⁵个/mL的细胞浓度。然后把细胞种在细胞培养皿（玻璃基底的培养皿）内，轻轻摇晃均匀，培养12小时后，每个培养皿内加入100μg/mL 的 Si-ce6，继续在Thermo 细胞培养箱里面（37℃，5% 二氧化碳，100%湿度）培养2小时。随后，吸取纳米材料，用磷酸缓冲液清洗细胞，彻底洗去未反应的材料。