专利名称：一种高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针及其制备方法
技术领域：
本发明属荧光探针材料领域，具体涉及一种具备高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针及其制备方法。
背景技术：
荧光探针在光学材料、化学 识别和生物监测及传感等领域得到了广泛的应用，并成为成功实现上述功能的一种主要的技术手段。但以传统的有机荧光染料为主的荧光探针中也存在一些难以克服的缺陷。近年来，量子点由于具有优良的光谱特征和光化学稳定性，因此量子点荧光探针的研究引起了国内外各学科研究者的广泛关注，研究的领域涉及物理、化学、生命科学等多学科，已经发展成为一门新兴的交叉学科。但是传统的量子点荧光探针具有生物相容性差，生物毒性等致命弱点，因此一种具有高的生物相容性和低的生物毒性的高亮度荧光探针的设计就迫在眉睫。
发明内容
为了克服传统量子点荧光探针的缺点，本发明的目的是通过水相合成的方法制备高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针。其是通过在二氧化硅表面连接大量的荧光量子点，使单个探针具有高于单个量子点几十上百倍的荧光增强效应，然后使用二氧化硅对二氧化硅/量子点纳米颗粒进行包裹，实现了好的生物相容性，非常容易链接生物分子，并彻底屏蔽了量子点的生物毒性。为了实现本发明的目的，本发明提供了一种高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针的制备方法，其包括如下步骤( I)制备二氧化硅球溶胶正硅酸四乙酯(TEOS)在一定比例氨水的催化作用下水解得二氧化硅溶胶；(2)制备二氧化硅与量子点复合材料用氨基硅烷偶联剂修饰步骤(I)所得的二氧化硅溶胶，然后将用3-巯基丙酸(MPA)稳定的水溶性荧光量子点加入到修饰过的二氧化硅溶胶中，充分反应后离心，将离心后固体产物分散在溶剂中得二氧化硅与量子点复合材料溶液；(3)制备二氧化硅-量子点-二氧化硅结构将氨水和正硅酸四乙酯加入步骤(2)制备的复合材料溶液中进行水解反应，水解反应结束后用硅烷偶联剂修饰水解产物，所得二氧化硅-量子点-二氧化硅结构表面带有各种基团，所述带各种基团的二氧化硅-量子点-二氧化硅结构连接多种生物分子后即为突光量子点纳米复合探针。其中，步骤(I)所述正硅酸四乙酯与氨水的体积比优选为O. 02^10 :0. 5 10。步骤(I)所述水解反应温度优选为2(Γ100 ，反应时间优选为广24小时。步骤(I)所述二氧化硅溶胶的尺寸优选为4(T200nm。其中，步骤(2)所述氨基硅烷偶联剂优选为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)或氨丙基三乙氧基硅烷。优选的，所述氨基硅烷偶联剂要过量以保证硅球表面被充分修饰，多余的偶联剂可以通过后续的离心除去；修饰后还进一步包括离心，以除去多余的硅烷偶联剂；修饰后使二氧化硅溶胶表面带上氨根基团。所述水溶性荧光量子点优选为CdTeS、CdTe, CdSe, Mn-doped ZnS, CdS或CdTe/CdS/ZnS等。优选的,所述量子点要过量以保证复合结构中有足够的量子点，多余的量子点通过后续的离心出去。步骤(2)中所述反应时间至少为6小时。步骤(2)中所述溶剂优选为乙醇、异丙醇等。其中，步骤(3)中所述复合材料的体积与加入的氨水和正硅酸四乙酯的体积和的比例为O. 02 4 :0. 5 4 ;其中所述正硅酸四乙酯与氨水的体积比优选为O. 02 10 :0. 5 10 ；所述水解反应条件为室温下反应24小时。 步骤(3)中所述硅烷偶联剂优选为带有各种基团(如氨基巯基)的硅烷偶联剂，如带有疏基基团的娃烧偶联剂(如Y-疏丙基二甲氧基娃(MPTMS))修饰后使其表面带有疏基集团；带有氨基基团的硅烷偶联剂(如3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS))修饰后使其表面带有氨基基团。优选的，所述偶联剂的用量还是要保持过量，多余的偶联剂可以通过后续离心除去。所述生物分子优选为抗体、链霉亲和素、DNA片段、生物配体或阳离子多肽等。本发明还提供了上述方法制备的荧光量子点纳米复合探针。本发明的有益效果相对于传统的荧光探针，此探针是一种无毒性，生物相容性好，易链接生物分子，闻突光纳米复合探针。(I)相对于传统的镉系量子点荧光探针的自身生物毒性，本发明的复合探针通过在最外层包裹一层二氧化硅壳的方式，隔绝了镉元素的泄露，可以有效的避免镉系量子点的生物毒性。(2)荧光量子点包括油溶性荧光量子点和水溶液荧光量子点，油溶性荧光量子点具有非常差的生物相容性，在实际应用层面上讲，水溶性量子点才能对生物体有好的相容性，水溶性量子点的一个缺点就是容易被水中的氧气氧化从而减弱甚至猝灭荧光，我们通过包裹二氧化硅壳可以同时实现三个功能好的生物相容性、彻底阻隔生物毒性以及阻止荧光淬灭效应。(3)商业化的荧光量子点表面的基团非常单一，本发明通过在最外层包裹一层二氧化硅壳后可以用带有各种电荷的硅烷偶联剂进行交联，使其带有所需要的基团以方便链接生物分子。(4)在一个商业化的量子点荧光探针中只包含一个荧光量子点，本发明的量子点荧光探针中含有数十上百个量子点可以大大提高材料的荧光强度。
图I是采用本发明制备的高亮度荧光量子点纳米复合探针；图2是高亮度荧光量子点纳米复合探针的应用示意图；图3是纯荧光量子点与荧光探针强度的对比图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述。本发明所用的化学药品正硅酸四乙酯(TE0S)，氨水，无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司。硅烷偶联剂(如3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS，sigma))、量子点如(CdTeS等)(中国科学技术大学物理系薄膜物理研究实验室)；实施例I :(I)将2ml的正硅酸四乙酯(TEOS)在4ml氨水的催化作用下水解，在40度下反应4小时制备直径为80nm的二氧化硅溶胶。(2)对制备好的二氧化硅溶胶用200微升的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)进行修饰，使其表面带上氨根基团，接着进行离心除去多余的APTMS，然后将5ml浓度为2M的MPA稳定水溶性荧光CdTeS量子点加入到修饰过的二氧化硅溶胶中，反应24小时使其充分反应，然后离心，将离心产物分散在乙醇中(乙醇用量为能够将离心下来的产物分散开就行了)。(3)向(2)中制备好的复合材料中加入2ml氨水和1000微升的TEOS，TEOS在氨水的催化下水解，反应条件为室温下反应24小时，反应结束后使用Y -巯丙基三甲氧基硅(MPTMS)进行修饰，使其表面带有巯基基团，其结构如图I所示，其结构是样品中间是二氧化硅球，中间是多个荧光量子点，最外层是二氧化硅球壳，最外层表面是用MPTMS修饰过。由于在一个复合纳米颗粒中包含有多个量子点，因此一个复合结构的荧光强度是单个量子点的55倍(如图2)，由于在荧光探针周围二氧化硅介质的存在，荧光探针的发射波长发生红移。(4)向(3)中制备好的带有巯基基团的量子点荧光复合纳米颗粒中加入抗体，抗体通过带有的氨基基团与探针表面的巯基结合在一起(示意图如图3)。由于抗体具有特异性，复合探针可以实现特异性标记。
实施例2 (I)将4. 4ml的正硅酸四乙酯(TEOS)在8ml氨水的催化作用下水解，在80度下反应2小时制备直径为150nm的二氧化硅溶胶。(2)对制备好的二氧化硅溶胶用500微升的氨丙基三乙氧基硅烷进行修饰，使其表面带上氨根基团，接着进行离心除去多余的APTMS，然后将IOml浓度为2M的MPA稳定水溶性荧光CdTe量子点加入到修饰过的二氧化硅溶胶中，反应24小时使其充分反应，然后离心并分散在异丙醇中。(3)向(2)中制备好的复合材料中加入4ml氨水和5000微升的TEOS，TEOS在氨水的催化下水解，反应条件为室温下反应24小时，反应结束后使用3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS))修饰后使其表面带有氨基基团。(4)向(3)中制备好的带有氨基基团的量子点荧光复合纳米颗粒中加入抗体，抗体通过带有的氨基基团与探针表面的巯基结合在一起。由于抗体具有特异性，复合探针可以实现特异性标记。实施例3 (I)将O. 55ml的正硅酸四乙酯(TEOS)在2ml氨水的催化作用下水解，在25度下反应12小时制备直径为IlOnm的二氧化硅溶胶。(2)对制备好的二氧化硅溶胶用100微升的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)进行修饰，使其表面带上氨根基团，接着进行离心除去多余的APTMS，然后将3ml浓度为2M的MPA稳定水溶性荧光Mn-doped ZnS量子点加入到修饰过的二氧化硅溶胶中，反应24小时使其充分反应，然后离心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制备好的复合材料中加入Iml氨水和500微升的TEOS，TEOS在氨水的催化下水解，反应条件为室温下反应24小时，反应结束后使用带有氨基基团的硅烷偶联齐U (如3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS))修饰后使其表面带有氨基基团。(4)向(3)中制备好的带有氨基基团的量子点荧光复合纳米颗粒中加入抗体，抗体通过带有的氨基基团与探针表面的氨基基团在交联剂的作用下结合在一起。由于抗体具有 特异性，复合探针可以实现特异性标记。实施例4 (I)将2. 2ml的正硅酸四乙酯(TEOS)在2ml氨水的催化作用下水解，在40度下反应4小时制备直径为50nm的二氧化硅溶胶。(2)对制备好的二氧化硅溶胶用200微升的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)进行修饰，使其表面带上氨根基团，接着进行离心除去多余的APTMS，然后将5ml浓度为2M的MPA稳定水溶性荧光CdTe/CdS/ZnS量子点加入到修饰过的二氧化硅溶胶中，反应24小时使其充分反应，然后离心并分散在乙醇中。(3)向(2)中制备好的复合材料中加入2ml氨水和3000微升的TEOS，TEOS在氨水的催化下水解，反应条件为室温下反应24小时，反应结束后使用Y -巯丙基三甲氧基硅(MPTMS)进行修饰，使其表面带有巯基基团。(4)向(3)中制备好的带有巯基基团的量子点荧光复合纳米颗粒中加入抗体，抗体通过带有的氨基基团与探针表面的巯基结合在一起。由于抗体具有特异性，复合探针可以实现特异性标记。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.ー种高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针的制备方法，其包括如下步骤 (1)制备ニ氧化硅球溶胶 正硅酸四こ酯在一定比例氨水的催化作用下水解得ニ氧化硅溶胶； (2)制备ニ氧化硅与量子点复合材料 用氨基硅烷偶联剂修饰步骤(I)所得的ニ氧化硅溶胶，然后将3-巯基丙酸稳定的水溶性荧光量子点加入到修饰过的ニ氧化硅溶胶中，充分反应后离心，将离心后固体产物分散在溶剂中得ニ氧化硅与量子点复合材料溶液； (3)制备ニ氧化硅-量子点-ニ氧化硅结构 将氨水和正硅酸四こ酯加入步骤(2)制备的复合材料溶液中进行水解反应，水解反应结束后用硅烷偶联剂修饰水解产物，所得ニ氧化硅-量子点-ニ氧化硅结构表面带有各种基团，所述带各种基团的ニ氧化硅-量子点-ニ氧化硅结构连接多种生物分子后即为荧光量子点纳米复合探针。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述正硅酸四こ酯与氨水的体积比为 O. 02 10 0. 5 10。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述水解反应温度为2(T10(TC，反应时间为Γ24小吋。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述ニ氧化硅溶胶的尺寸为40 200nm。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基ニ甲氧基娃氧烧或氣丙基ニこ氧基娃烧。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述水溶性荧光量子点为CdTeS、CdTe,CdSe、Μη-doped ZnS,CdS 或 CdTe/CdS/ZnS。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应时间至少为6小时；所述溶剂为こ醇、异丙醇。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述复合材料的体积与加入的氨水和正硅酸四こ酯的体积和的比例为O. 02^4 :0. 5^4 ;其中所述正硅酸四こ酯与氨水的体积比为O. 02 10 :0. 5 10。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述硅烷偶联剂为こ烯基硅烷偶联剂、氣基娃烧偶联剂、环氧基娃烧偶联剂、甲基丙稀酸氧基娃烧偶联剂、疏基娃烧偶联剂或脲基硅烷偶联剂。
10.权利要求Γ9任意一项所述方法制备的荧光量子点纳米复合探针。
全文摘要
本发明提供了一种高亮度无毒性荧光量子点纳米复合探针的制备方法，其包括如下步骤(1)制备二氧化硅球溶胶；(2)制备二氧化硅与量子点复合材料；(3)制备二氧化硅-量子点-二氧化硅结构。本发明是通过在二氧化硅表面连接大量的荧光量子点，使单个探针具有高于单个量子点几十上百倍的荧光增强效应，然后使用二氧化硅对二氧化硅/量子点纳米颗粒进行包裹，实现了好的生物相容性，非常容易链接生物分子，并彻底屏蔽了量子点的生物毒性。
文档编号C09K11/02GK102851021SQ201210367080
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者尹乃强, 许小亮, 朱立新 申请人:中国科学技术大学